背景及意义：骨移植主要用于修复骨缺损和促进骨再生,在骨科及口腔颌面外科领域已经被广泛应用。目前临床上骨移植材料的种类最主要包括自体骨、同种异体骨、异种骨、人工合成骨及复合骨。自体骨作为植骨的“金标准”已经成为共识,但骨量有限,难以满足大范围骨缺损的修复。同种异体骨是目前临床上常用的材料,主要用于修复、填充骨缺损,具有固定和支撑作用,但其来源亦有限,尚不能完全满足临床植骨需求。异种骨材料来源广泛,如果经过合适程序处理后可以作为骨移植替代材料,能够很好地解决临床上自体骨与同种异体骨来源不足的问题,然而异种骨面临的主要问题是如何采取适当的工艺降低其免疫原性及免疫排斥反应,同时尽量保留其骨传导及骨诱导能力,以达到良好的植骨融合效果。我国是一个人口众多、地域辽阔的发展中国家,生产事故、交通意外、地质灾害等时有发生,造成伤亡事故导致的骨缺损病例大量存在,因此我国对骨缺损材料需求量较大。异种骨来源丰富,可以满足这一需求,但其移植后会发生免疫排斥反应影响移植骨的融合效果,为解决其免疫排斥,学者们相继研究出多种不同的处理方法,目前市场上已出现多种能应用于临床的异种骨,如Bio-OSS、RBX重组合异种骨,治疗效果显著,安全性也得到认可。目的：本实验分细胞学实验及免疫学实验两部分,细胞学实验采用材料在体外与细胞共培养,通过Transwell试验测定成骨细胞的迁移能力,流式细胞仪检测成骨细胞的细胞周期和细胞凋亡情况,ANPP法检测AFP,MTT法评价异种骨的细胞毒性,溶血试验观察材料与血液的相容性情况。结合上述方法来综合评价异种骨与成骨细胞的体外的成骨能力和生物相容性。免疫学实验通过建立羊颈椎异种骨融合器植入动物模型,观察异种骨植入后分时段抽取动物模型血液,通过流式细胞仪来检测不同时间点CD4+及CD8+淋巴细胞,CD4+/IL-2+T细胞及CD4+/IL-4+T细胞的含量来评定免疫排斥反应情况,进一步为生物型异种骨移植材料应用于临床提供安全性和有效性的依据。材料：生物型异种松质骨：由广东冠昊生物科技股份有限公司采用已获得美国专利授权(US6106555A, US6231614B1)的技术制备；生物型异种骨颈椎融合器：由广东冠昊生物科技股份有限公司制备；SD大鼠成骨细胞株由广州军区总医院骨科实验室液氮冻存；成年本地山羊18只,体重25～30kg,由广东冠昊生物科技有限公司动物实验中心提供。第一章异种骨生物相容性细胞学研究方法：实验分成3组,分别是实验组(交联的异种骨组),阳性对照组(未交联的异种骨组)和阴性对照组。实验组将交联的异种骨与SD大鼠成骨细胞在H-DMEM培养基中进行共培养；阳性对照组将未交联的异种骨与SD大鼠成骨细胞在H-DMEM培养基中进行共培养；阴性对照组将SD大鼠成骨细胞直接在普通H-DMEM培养基中单独培养。分别于培养后1、3、5、7天用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)法测定吸光度值,以评价细胞的增殖情况,反应异种骨的细胞毒性及生物相容性。采用PNPP偶氮法分别测定3天,1周,2周,3周时的ALP量,以评价异种骨对成骨细胞成骨的影响。应用流式细胞仪检测细胞周期变化以及成骨细胞凋亡情况,以评价异种骨对成骨细胞细胞周期和凋亡的影响。取新西兰大白兔静脉血进行异种骨的急性血溶试验,评价异种骨与血液的生物相容性。Transwell试验分成4个组,分别为A1组：未交联的异种骨组,A2组：A1组的对照组；和B1组：交联的异种骨组,B2组：B2组的对照组。在倒置相差显微镜下观察细胞的迁移情况,测定穿膜成骨细胞数量,评价成骨细胞的迁移能力。实验数据采用SPSS20.0统计软件进行分析,以均数±标准差(x+s)表示,实验数据采用方差分析和LSD-t检验或Tamhane多重比较检验,P<0.05为有统计学意义。结果：1成骨细胞增殖活性培养1、3、5、7 d后在显微镜下观察可见实验组,阳性对照组及阴性对照组成骨细胞形态均良好。实验组与对照组相比,随着培养时间延长,OD值均升高,在1d、3d、5d、7d时间点,三组间比较采用方差分析和LSD-t检验,数据统计学分析显示同一时间点三个组间吸光度值两两比较差别均无显著统计学差异(P>0.05),MTT法测定OD值可间接反应细胞增殖数量,表明异种骨材料对成骨细胞增殖活性无不良影响,与成骨细胞相容性良好,无明显细胞毒性。2 PNPP偶氮法测定出ALP的OD值加入成骨诱导液后3天后在显微镜下观察三个组的成骨细胞形态,结果显示三个组H-DMEM培养基中生长的成骨细胞形态均良好,采用PNPP法测定OD值可间接反应细胞成骨能力,本实验结果显示随着培养时间延长,三个组OD值均升高,表明三组细胞生长状态良好。三组间比较采用方差分析和LSD-t检验,统计学分析结果显示3天及7天时3组间两两比较均无显著统计学差异(P>0.05)；2周及3周时,实验组及阳性对照组跟阴性对照组比较差别均有显著统计学差异(P<0.05),实验组跟阳性对照组比较差别有显著统计学差异(P<0.05)。3流式细胞术检测成骨细胞周期采用流式细胞术检测Millipore软件分析实验结果显示：A组G0/G1、S、G2/M分别所占细胞周期百分比为：70.10±1.1%、3.82±0.02%、16.56±0.02%；B组GO/G1、S、G2/M分别所占细胞周期百分比为：70.10±0.20%、3.82±0.02%、16.56±0.01%；对照组GO/G1、S、 G2/M分别所占细胞周期百分比为：70.20±0.04%、3.86±0.02%、16.52±0.05%。三组间比较采用方差分析和LSD-t检验,GO/G1、S、G2/M三组数据统计学分析显示三组间两两比较差别均无显著统计学差异(P>0.05),可见三组细胞G0/G1期、S期、G2/M期分布比例相似,表明两种异种骨对成骨细胞细胞周期均无不良影响。4成骨细胞的迁移能力Transwell试验中通过在高倍镜下(×200)随机取5个视野计数,计数每个视野的平均细胞数量评价成骨细胞在普通培养基与含异种松质骨培养基的迁移能力。本实验中实验组随机取5个视野计得平均迁移的细胞数目结果为：A1组：13.42±0.02个/视野,A2组：8.00±0.02个/视野；B1组：13.41±0.02个/视野,B2组：8.00±0.07个/视野；两组间比较采用方差分析和Tamhane多重比较,以均数±标准差(x+s)表示,数据统计学分析显示A1与A2之间比较有显著统计学差异(P<0.05)；B1与B2之间比较有显著统计学差异(P<0.05)；A1与B1之间比较无显著统计学差异(P>0.05)。5细胞凋亡实验流式细胞仪结果经过Guava Nexin软件分析显示24小时3各组细胞凋亡率为A组：0.87±0.01%；B组：0.88±0.03%；C组：0.91±0.01%。48小时3各组细胞凋亡率为A组：2.16±0.03%：B组：2.20±0.01%；C组：6.19±0.06%。三组间比较采用方差分析和LSD-t检验,24h时,三组数据统计学分析显示三组间两两比较差别均无统计学差异(P>0.05)：48h时三组数据统计学分析显示交联异种骨组与阴性对照组间比较无显著统计学差异(P>0.05),未交联的异种骨组与阴性对照组间比较有显著统计学差异(P<0.05),未交联的异种骨组与交联异种组间比较有显著统计学差异(P<0.05)。说明24小时内两种异种骨共培养后不会影响成骨细胞的凋亡,48小时时,交联的异种骨对成骨细胞的凋亡无明显影响,然而这时未交联的异种骨对能够明显促进成骨细胞的凋亡。6溶血实验 肉眼下可见两种异种骨组离心管中上清液呈无色透明,与阴性对照组管中的上清液颜色接近一致,无明显溶血现象发生；阳性对照组离心管中上清液呈玫瑰红色,红细胞完全破裂溶解。实验材料中未交联异种骨组的溶血率为1.13%,与阴性对照组相比无显著统计学差异(P>0.05),无明显溶血反应；交联的异种骨组溶血率为1.02%,且值与阴性对照组相比无显著统计学差异(P>0.05),符合溶血标准,不会引起明显溶血反应结论：1,生物型异种骨体外培养状态下可以促进大鼠成骨细胞的成骨能力和迁徙能力,交联后的异种骨比未经交联处理的异种骨这种促进作用更加明显。2,生物型异种骨体外培养状态下24小时内对大鼠成骨细胞的凋亡无明显影响,48小时时,未交联的异种骨可以明显增加成骨细胞的凋亡率,而交联后的异种骨无此影响。3,生物型异种骨体外培养状态下对大鼠成骨细胞成骨的增殖活性和细胞周期无不良影响,不会引起明显溶血反应,具有良好的生物相容性。第二章异种骨生物相容性免疫学研究方法：18只成年本地山羊,体重25-30kg,随机分成3组,每组6只。A组为自体髂骨组,手术植入自体髂骨,钢板固定；B组为异种骨融合器组,手术植入异种骨融合器加自体骨,钢板固定；C组为阴性对照组,不给予手术处理,用于对照。分别于1w、2w、4w、8w抽取实验动物血液20ml,应用流式细胞仪分别测定各个时间点各组血标本中CD4+/IL-2+, CD4+/IL-4+; CD4+, CD8+T淋巴细胞的含量,用于评价山羊对异种骨免的疫排斥反应情况。实验数据采用SPSS20.0统计软件进行分析,以均数±标准差(x+s)表示,实验数据采用方差分析和LSD-t检验,P<0.05为有显著统计学差异。结果：1一般情况 1只山羊术后当天因麻醉相关并发症死亡,当天补上1只替代。所有山羊术后正常进食及野外放养,每天观察伤口情况,术后部分山羊切口轻度肿胀,5天后肿胀基本消失。术后所有伤口愈合良好。2标本大体观察术后12周时A组颈3/4椎体间大部分融合,融合节段可见大量骨痂形成；B组融合器与上下椎体融合较差,结合处可见少量骨痂。术后24周时A组两椎体完全融合,B组融合效果欠佳。3 CD4+及CD8+T细胞测定结果 1周时,三个组间两两比较均无显著统计学差异(P>0.05)；2周时,自体骨组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞数值比较均无显著统计学差异(P>0.05)；自体骨组与异种骨融合器组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值相比较均有显著统计学差异(P<0.05)；异种骨融合组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值比较均有显著统计学差异(P<0.05)；4周时,自体骨组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值比较均无显著统计学差异(P>0.05)；自体骨组与异种骨融合器组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值相比较均有显著统计学差异(P<0.05)；异种骨融合组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值比较均有显著统计学差异(P<0.05)；8周时,自体骨组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞数值比较均无显著统计学差异(P>0.05)；自体骨组与异种骨融合器组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值相比较均无显著统计学差异(P>0.05)；异种骨融合组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值比较均无显著统计学差异(P>0.05)。4 CD4+/IL-2+T细胞及CD4+/IL-4+T细胞测定结果1周时,自体骨组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异(P>0.05),异种骨融合器组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异(P>0.05),异种骨融合组与自体骨组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异(P>0.05)；2周时,自体骨组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异(P<0.05),异种骨融合器组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异(P<0.05),异种骨融合器组与自体骨组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较,均无显著统计学差异(P>0.05)；4周时,自体骨组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异(P<0.05)；异种骨融合器组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异(P<0.05)；异种骨融合组与自体骨组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异(P<0.05)；8周时,自体骨组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异(P>0.05),异种骨融合器组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异(P>0.05),异种骨融合组与自体骨组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异(P>0.05)结论：1,异种骨椎间融合器植入羊体内后早期会引起免疫排斥反应导致CD4+及CD8+T细胞及CD4+/IL-2+T及CD4+/IL-4+T细胞升高,4W左右最显著,随后逐渐下降,8周时CD4+及CD8+T细胞及CD4+/IL-2+T及CD4+/IL-4+T细胞数量逐渐接近正常。2,手术创伤,疼痛可以引起山羊体内的应激反应导致体内CD4+/IL-2+T细胞及CD4+/IL-4+T细胞数目升高,这种效应术后就开始,2周开左右达到最高,可以维持到术后4周左右,然而这种应激反应却不能引起CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的升高。