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研究背景子痫前期(preeclampsia,PE)是一种严重危害母儿健康的妊娠并发症,主要表现为妊娠20周后孕妇新发的高血压并伴有一种或多种器官功能障碍。PE的发病率为2%-8%,是导致孕产妇和围产儿高发病率和死亡率的主要原因之一。PE的病因以及发病机制到目前为止还没有完全明确,研究者普遍认为,胎盘滋养细胞侵润能力下降,子宫螺旋动脉无法顺利重铸,导致胎盘“浅着床”是PE发病的关键环节。目前还未发现对PE有效的预防和治疗措施,终止妊娠是唯一能够阻止疾病进展的方法,但会由此引发医源性早产相关的不良妊娠结局。因此寻找PE发病过程中关键的调控分子,深入研究其在PE发病过程中的作用和分子机制,对于阐明PE的病因、实现PE的早期诊断和治疗具有重要的意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类没有蛋白编码能力,长度大于200个核苷酸的RNA转录本。研究发现,lncRNA可在表观遗传水平、转录水平及转录后水平调控基因的表达和功能,参与细胞分化、增殖、凋亡和侵袭等多种生物学过程。lncRNA与多种疾病的发生发展密切相关,包括肿瘤、糖尿病、神经退行性病变及心血管疾病等。目前已经发现PE患者胎盘组织、蜕膜组织和外周血中存在多种异常表达的lncRNA,但lncRNA在PE中的研究还处于早期阶段,大量lncRNA的功能及其作用机制有待发掘。鉴于此,本研究首先使用lncRNA芯片技术筛选出PE患者和正常妊娠孕妇胎盘组织中差异表达的lncRNA。然后使用人孕早期绒毛外滋养细胞系(HTR-8/SVneo)进行体外细胞实验,检测过表达和敲低MIR193BHG对其生物学行为的影响。最后使用RNA测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术对过表达MIR193BHG的HTR-8/S Vneo细胞株进行转录组测序,筛选并验证MIR193BHG可能调控的下游基因和信号通路,从而初步探讨MIR193BHG参与PE发病的分子机制。本研究主要分为以下三个部分:第一部分 子痫前期胎盘组织差异表达lncRNA的筛选和验证目的1.利用lncRNA芯片技术,筛选出子痫前期孕妇和正常妊娠孕妇胎盘组织中差异表达的lncRNA。2.对候选lncRNA在扩大的胎盘组织样本中进行验证,并分析其对子痫前期的临床诊断价值,最终筛选出后续研究的lncRNA分子。方法1.收集2018年5月至2019年7月之间,在郑州大学第三附属医院行剖宫产分娩,临床诊断为早发子痫前期的30例孕妇的胎盘组织作为PE组;同时收集30例正常妊娠孕妇的胎盘组织作为对照组。2.应用lncRNA芯片检测4例PE组样本和4例对照组样本lncRNA的表达谱,以变化倍数>2,P<0.05为筛选标准,筛选出子痫前期胎盘组织中异常表达的lncRNA。3.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测30例PE组样本和30例对照组样本MIR193BHG、PROX1-AS1和GATA3-AS1的表达水平。4.使用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析胎盘组织MIR193BHG、PROX1-AS1和GATA3-AS1对子痫前期的临床诊断价值。结果1.lncRNA芯片分析结果显示,与对照组比较,PE组共有246个差异表达的lncRNA(差异倍数>2,P<0.05),其中表达上调的lncRNA有159个,表达下调的有87个。2.qRT-PCR结果表明,PE组MIR193BHG(P<0.001)、PROX1-AS1(P<0.05)和GATA3-AS1(P<0.05)表达水平均显著高于对照组。3.ROC曲线分析结果显示,MIR193BHG曲线下面积为0.819(P<0.001,95%置信区间:0.711-0.927),GATA3-AS1 曲线下面积为 0.690(P<0.05,95%置信区间:0.556-0.824),PROX1-AS1 曲线下面积为 0.640(P>0.05,95%置信区间:0.498-0.782)。MIR193BHG对于子痫前期具有较好的临床诊断价值。小结1.子痫前期患者胎盘组织中lncRNA表达谱有明显改变。2.胎盘组织MIR193BHG表达水平升高,可能与子痫前期的发病有关。第二部分 MIR193BHG对滋养细胞生物学行为的影响目的研究MIR193BHG对滋养细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为的影响,进一步揭示MIR193BHG在子痫前期发病中的作用机制。方法1.RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)和核质分离实验检测MIR193BHG在HTR-8/SVneo细胞中的亚细胞定位。2.使用 MIR193BHG Smart Silencer 转染 HTR-8/SVneo 细胞,构建MIR193BHG低表达细胞模型,利用qRT-PCR技术进行敲低效率的检测。3.使用MIR193BHG过表达质粒转染HTR-8/SVneo细胞,构建MIR193BHG过表达细胞模型,利用qRT-PCR技术进行过表达效率的检测。4.CCK-8实验检测敲低和过表达MIR193BHG对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响。5.划痕实验检测敲低和过表达MIR193BHG对HTR-8/SVneo细胞迁移能力的影响。6.Transwell实验检测敲低和过表达MIR193BHG对HTR-8/SVneo细胞侵袭能力的影响。7.应用Annexin V-FITC/PI试剂盒染色,流式细胞仪检测敲低和过表达MIR193BHG对HTR-8/SVneo细胞凋亡能力的影响。结果1.RNA-FISH和核质分离实验结果显示,MIR193BHG同时存在于细胞核和细胞质中,且以细胞核分布为主。2.qRT-PCR 结果显示,HTR-8/SVneo 细胞转染 MIR193BHG Smart Silencer后,MIR193BHG的表达水平显著低于对照组(P<0.05);HTR-8/SVneo细胞转染MIR193BHG过表达质粒后,MIR193BHG的表达水平显著高于对照组(P<0.001)。3.CCK-8实验结果显示,MIR193BHG敲低组HTR-8/SVneo细胞在24h、48h和72h细胞增殖能力均显著高于对照组(P<0.05,0.01,0.01);MIR193BHG过表达组HTR-8/SVneo细胞在24h、48h和72h细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.05,0.001,0.01)。4.流式细胞术结果显示,MIR193BHG敲低组HTR-8/SVneo细胞凋亡率显著低于对照组(P<0.05);MIR193BHG过表达组HTR-8/SVneo细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.001)。5.划痕实验结果显示,划痕24h后,MIR193BHG敲低组和对照组HTR-8/SVneo细胞迁移能力无明显差异(P>0.05);划痕48h后,MIR193BHG敲低组HTR-8/SVneo细胞迁移能力显著高于对照组(P<0.05);划痕24h和48h后,MIR193BHG过表达组HTR-8/SVneo细胞迁移能力均显著低于对照组(P<0.001,0.05)。6.Transwell侵袭实验结果显示,MIR193BHG敲低组HTR-8/SVneo细胞侵袭能力显著高于对照组(P<0.05);MIR193BHG过表达组HTR-8/SVneo细胞侵袭能力显著低于对照组(P<0.05)。小结MIR193BHG可能通过抑制滋养细胞增殖、迁移和侵袭,促进滋养细胞凋亡,参与子痫前期的发生发展。第三部分 MIR193BHG影响滋养细胞生物学行为的机制探索目的1.探索MIR193BHG调控的下游分子和信号通路,进一步探讨MIR193BHG参与子痫前期的发病机制。2.在细胞水平上验证MIR193BHG是否能够通过p53途径,影响滋养细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为。方法1.使用RNA-seq技术检测MIR 193BHG过表达组和对照组HTR-8/SVneo细胞的mRNA表达谱,以|logFC|>0.5,P<0.05为筛选标准,筛选差异表达的mRNA。2.针对差异表达的mRNA,同时进行KEGG通路富集和蛋白-蛋白相互作用网络构建,筛选MIR193BHG调控的下游分子和信号通路。3.使用qRT-PCR和Western Blot检测过表达MIR193BHG后HTR-8/SVneo细胞中p53 mRNA和蛋白的表达水平。4.使用p53 小干扰RNA(siRNA)转染HTR-8/SVneo细胞,通过qRT-PCR和Western Blot技术检测p53 mRNA和蛋白表达水平。5.将HTR-8/SVneo细胞为三组:共转染MIR193BHG过表达质粒和p53-siRNA组(MIR193BHG-OE+p53-siRNA)、转染MIR193BHG过表达质粒和siRNA阴性对照组(MIR193BHG-OE+NC-siRNA)、转染空载质粒和siRNA阴性对照组(NC-OE+NC-siRNA)。使用CCK-8、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验,检测各组细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。结果1.RNA-seq共筛选到差异表达基因147个(|logFC|>0.5,P<0.05),其中在MIR193BHG过表达组表达上调的有63个,表达下调的有84个。2.差异表达基因KEGG通路富集分析结果表明:差异表达基因主要在细胞衰老、细胞周期、流体切应力和动脉粥样硬化、p53信号通路富集。蛋白-蛋白相互作用网络显示,TP53为网络中的核心基因。3.qRT-PCR检测结果显示,MIR193BHG过表达组p53 mRNA相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)。Western Blot结果显示,MIR193BHG过表达组p53蛋白相对表达水平显著高于对照组(P<0.05)。4.与阴性对照组比较,转染p53-siRNA后,HTR-8/SVneo细胞p53 mRNA和蛋白表达水平均下调显著(P<0.001)。p53-siRNA-3敲低效率相对较高,用于进行后续实验。5.共转染MIR193BHG过表达质粒和p53-siRNA后,与(NC-OE+NC-siRNA)组比较,(MIR193BHG-OE+NC-siRNA)组HTR-8/SVneo细胞增殖能力在24h、48h和72h均显著下降(P<0.05,0.001,0.001);与(MIR193BHG-OE+NC-siRNA)组 比 较,(MIR193BHG-OE+p53-siRNA)组 HTR-8/SVneo 细胞增殖能力在 24h 无显著差异(P>0.05),在48h和72h显著升高(P<0.05,0.05)。与(NC-OE+NC-siRNA)组比较,(MIR193BHG-OE+NC-siRNA)组HTR-8/SVneo 细 胞 凋 亡率 显 著 升 高(P<0.01);与(MIR193BHG-OE+NC-siRNA)组比较,(MIR193BHG-OE+p53-siRNA)组HTR-8/SVneo 细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与(NC-OE+NC-siRNA)组比较,(MIR193BHG-OE+NC-siRNA)组HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力显著下降(P<0.01,0.01);与(MIR193BHG-OE+NC-siRNA)组比较,(MIR193BHG-OE+p53-siRNA)组HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力显著增加(P<0.05,0.05)。小结MIR193BHG可能通过p53途径,调控滋养细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,进而参与子痫前期的发病。结论1.胎盘组织长链非编码RNA MIR193BHG表达升高可能与子痫前期的发病有关。2.长链非编码RNA MIR193BHG可能通过p53途径,抑制滋养细胞的增殖、迁移和侵袭,促进滋养细胞的凋亡,参与子痫前期的发病。