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研究背景:近年来,非淋菌性尿道炎(NGU)的发病率在西方国家已超过淋病,居性传播疾病的首位,我国的患病率亦迅猛增加,日益引起人们的重视。在NGU中,沙眼衣原体(Chlamydia trachomatics,Ct)感染是最常见的。泌尿道的Ct感染可导致多种疾病,引起严重的并发症、后遗症。因此,治疗Ct感染十分重要。Ct主要对大环内酯类、四环素类、喹诺酮类及利福平等抗生素敏感。而四环素类及喹诺酮类不能用于孕妇及婴幼儿,临床治疗Ct时多使用大环内酯类抗生素。随着大环内酯类抗生素在临床上广泛的应用,Ct耐药性的报道也陆续出现。细菌对大环内酯类药物的耐药机制主要是:①ermB基因引起的靶位改变。②主动外排。③50S核糖体突变:包括23S rRNAII区及V区以及L4、L22的突变。④钝化酶的产生。近年国外对氟喹诺酮和利福平耐药的Ct突变株已经在体外被成功诱导,并发现喹诺酮类是QRDR基因突变,而利福平则是rpoB基因突变。体外诱导肺炎衣原体对阿奇霉素耐药不成功,但诱导CtL2型却成功。目前国内对Ct耐药情况的报道较少,更没有关于诱导耐药问题的文献报道。本实验拟在体外测定红霉素、阿奇霉素、交沙霉素对Ct的敏感性,并用次抑菌浓度的三种大环内酯类药物诱导Ct耐药突变,探讨其诱导耐药机制。
目的:测定红霉素、阿奇霉素、交沙霉素对Ct的MIC,再用次抑菌浓度的药物诱导Ct的耐药,通过基因分析,探讨其耐药的产生机制。
资料与方法:
1.标本的收集与培养
临床株13株,标准株l株。用细胞培养法进行培养和传代。
2.药物敏感实验
2.1设置药物浓度(单位mg/L)。
2.2确定能引起90%以上细胞感染的Ct的接种量。
2.3最低抑菌浓度(MIC)测定。
3.次抑菌浓度诱导耐药
在生长培养液中加入1/2MIC浓度的红霉素、阿奇霉素和交沙霉素,进行Ct的接种与收集。连续传代,每四代测定MIC,当测得MIC≥4倍诱导前MIC,则诱导耐药成功。
4.耐药机制的研究方法
4.1 L4耐药机制的研究:制备基因组DNA,PCR扩增L4,测序。
4.22 3S rRNA耐药机制的研究:提取总RNA,逆转录制备cDNA,PCR扩增23SrRNA,测序。
结果:
1.MIC:经过对13株临床Ct标本的测定,证实红霉素、阿奇霉素及交沙霉素的MIC范围分别为:0.5~1mg/L,0.5~1mg/L,0.04~0.16mg/L。
2.13株临床标本均成功诱导了对大环内酯类的耐药性。
3.基因分析显示,L4的临床株和标准株均有相同的突变,其突变与大环内酯类药物耐药无关。23SrRNA有A2059G、A2057G、T2611C、A2093T位点的突变,与耐药性有关,而所产生的A2131T和C2452A位点突变可能为无义突变。没有诱导出在细菌中常见的A2058突变。
结论:
1.就目前来说,大环内酯类抗生素对Ct依然是敏感的。
2.可以用次抑菌浓度的大环内酯类抗生素在体外诱导Ct的耐药性。
3.诱导耐药株中,23S rRNA的突变有A2059G、A2057G、T2611C、A2093T,其中以2611位点突变为常见。虽然也可以产生A2131T和C2452A突变,但这两个位点的突变可能与耐药性无关。诱导中,也可以使L4发生突变,但与耐药性无关。