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小脑位于枕叶下方、脑干上方的颅后窝。越来越多研究表明,小脑不仅是运动控制器官,也参与了包括语言、情感和社交等在内的多种高级认知功能的调节。此外,由于其独特而清晰的分叶和分层结构、相对简单的细胞类型,使得小脑成为研究神经发育分子机制的一个比较理想的范式,但目前调控小脑发育的信号机制尚未完全阐明。在本研究中,我们发现了一个调控小脑发育的关键分子RACK1（Receptor for activated C kinase 1）。RACK1作为一个富含7个WD40重复结构域（WDR）的接头蛋白分子,其表达与功能都非常广泛。在已经发现的286种WDR蛋白家族成员中,部分WDR蛋白参与了大脑发育的调节。但有关RACK1在脑发育中的确切功能目前仍一无所知。由于RACK1全身突变小鼠具有胚胎致死性,因此,在本课题中,我们通过借助条件性敲除策略,利用前期制备的RACK1lox P小鼠,构建了多种细胞特异性条件敲除小鼠模型,以期深入探讨RACK1在调控神经发育中的确切功能及分子机制。首先,我们发现利用Nestin-Cre在胚胎早期（E9.5）神经干细胞中特异性敲除RACK1具有胚胎致死性,而选择hGFAP-Cre在胚胎中期（E11.5）神经干细胞中特异性敲除RACK1后,小鼠能存活3周左右的时间,且表现出典型的共济失调和平衡缺陷。解剖发现,hGFAP-RACK1-/-突变小鼠伴有严重的大脑和小脑发育缺陷表型。在本研究中,我们重点围绕RACK1突变小脑小叶生成减少和皮质分层紊乱的发育不良表型展开了后续深入研究。由于小脑中hGFAP-Cre+神经干细胞能够分化为颗粒神经元（granular neurons）及伯格曼胶质细胞（Bergmann glial cells）,之后我们分别回答了RACK1在小脑颗粒神经元和伯格曼胶质细胞发育中所起的不同作用及其对小脑发育的贡献。在颗粒神经元前体细胞（Math1-Cre）中特异性敲除RACK1能够获得同神经干细胞中特异性敲除RACK1(hGFAP-RACK1-/-)相类似的缺陷表型,其核心原因都表现为小脑颗粒神经元前体细胞增殖能力降低以及向内迁移受阻。而在伯格曼胶质细胞（GLAST-Cre-ERT）中条件性敲除RACK1后,并不影响伯格曼胶质细胞及小脑的形态学发生。有意思的是,在神经干细胞和颗粒神经元前体细胞中敲除RACK1都会显示出伯格曼胶质细胞和浦肯野神经元发育的明显异常,这提示RACK1可通过直接调控颗粒神经元的发育而以非细胞自主性方式影响伯格曼胶质细胞和浦肯野神经元的形态学发生。该结果还进一步证实,小脑的发育是不同类型神经细胞之间相互作用、互为协同的结果。最后,我们还围绕RACK1在浦肯野细胞中的功能展开了初步探讨,发现RACK1除了可通过非细胞自主性方式调节浦肯野细胞发育外,还可以细胞自主性方式直接调控其功能,并影响小脑特定分叶的融合和运动平衡功能。通过构建不同细胞类型特异性RACK1敲除小鼠,我们证实了RACK1可通过分别调节小脑神经干/前体细胞以及颗粒神经元前体细胞的增殖、迁移和分化,进而影响小脑的发育和成熟。无论是体内还是体外培养的颗粒神经元中特异性敲除RACK1都会导致WNT/β-catenin信号异常激活,而SHH-Gli信号通路则受到显著抑制。只有在神经干/前体细胞,而非颗粒神经元前体细胞中敲除β-catenin,能够“挽救”RACK1敲除小鼠小脑的缺陷表型。研究还发现,RACK1本身还可通过直接结合SHH通路上的Smoothened受体发挥正向激活作用;RACK1缺失还会导致HDACs家族成员中HDAC1/2蛋白水平显著下降。进一步实验结果表明,RACK1稳定HDAC1/HDAC2蛋白水平的作用主要依赖于降低其泛素化修饰水平,进而抑制蛋白酶体系统对其降解,而HDAC1/HDAC2对SHH通路下游Gli1的转录发挥至关重要的调节作用。由此可见,RACK1可通过直接激活Smoothened受体,或通过稳定HDAC1/2蛋白水平增加Gli1转录的方式间接促进SHH信号的激活。最后,在发育早期小脑中给予HDAC1/2药理学抑制剂进行处理,能够完全模拟颗粒细胞元前体细胞中RACK1缺失所产生的缺陷表型。此外,通过阻断RACK1与PKC信号分子之间的相互作用,我们发现,既不会影响颗粒神经元前体细胞的发育,也不会影响包括Wnt/β-catenin和HDAC1/HDAC2在内关键信号分子的表达。因此,在小脑发育过程中,RACK1可通过调控不同发育阶段和不同细胞亚型的细胞命运和发育走向,进而决定小脑的形态发生和精细结构的形成。解析这一复杂发育生物学现象背后的信号机制,我们发现一方面与RACK1抑制WNT/β-catenin信号通路的过度活化密切相关;另一方面,也依赖于RACK1对SHH信号通路的激活,而此过程在很大程度上依赖于RACK1对HDAC1/HDAC2蛋白稳定性的调控作用。作为激活型PKC信号分子的受体,在调控小脑发育过程中,RACK1所介导的WNT/β-catenin和SHH信号通路的调控却并不依赖其同PKC之间的相互作用。总而言之,我们分别在小鼠体内、细胞及分子层面系统阐述了RACK1在小脑发育中的功能及其作用机制。由于小脑颗粒细胞的异常增生与临床上髓母细胞瘤的发生密切相关,我们的工作不仅对深入理解和揭示调控小脑发育的分子机理具有重要的科学价值,同时,有望为临床髓母细胞瘤的分子分型诊断及靶向治疗提供重要参考靶点。