蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase,SPase）是糖苷水解酶13家族中的一类,可以催化蔗糖发生可逆的磷酸解反应。基于其广泛的底物混杂性,葡萄糖基团可以被SPase转移至甘油、D-葡萄糖和D-半乳糖上,所合成的产物2-O-α-D-甘油葡萄糖苷（2-O-α-D-Glucosylglycerol,αGG）、曲二糖及蜜二糖,在食品、医药及化妆品中具有广泛的应用。利用SPase催化产生的化合物在工业上用途广泛,因此该酶引起了人们越来越多的关注。目前,来源于肠膜明串珠菌的蔗糖磷酸化酶（Lm SP）在工业上的应用仍然受到许多限制,如该酶的热稳定性较低,对D-葡萄糖和D-半乳糖的转糖基化活性也不高。因此,本研究以Lm SP野生型菌株为初始菌株,通过半理性设计改造Lm SP的热稳定性,并利用SPase催化合成2-O-α-D-甘油葡萄糖苷,以及通过分子改造提高Lm SP对D-葡萄糖和D-半乳糖的转糖基化活性。主要研究结果如下:1、通过半理性方法改造野生型SPase,获得了两个热稳定性和活性均提高的突变体。利用同源建模,构建了来源于肠膜明串珠菌的蔗糖磷酸化酶的三维模拟结构,然后利用PROSS以及Fire Prot这两种方法对模拟的三维结构进行提高稳定性的突变体预测,随后构建了一个小型的突变体文库。初次筛选获得了两个优良的突变体,并将其进行组合突变。V23L、S424R和V23L/S424R突变体的酶活分别是野生型的1.1、1.5及1.75倍。测定的酶学参数结果表明突变体V23L和V23L/S424R在50℃的半衰期分别为57.5 min和27.1 min,且V23L和V23L/S424R的T50值相比野生型均提高了7℃左右。2、利用野生型SPase和两个正向突变体合成2-O-α-D-甘油葡萄糖苷,并优化了反应条件。在相同反应条件下,V23L和V23L/S424R的αGG产量是野生型的1.27倍。αGG最适的反应条件为:当甘油的浓度为3.2 mol·L-1,蔗糖的浓度为1.2 mol·L-1,酶浓度为40 U·m L-1,温度为37℃,经过60 h反应后,αGG的产量达到最大。此时,野生型、V23L和V23L/S424R的αGG浓度分别为190.6、206.6和217.2 g·L-1,且与野生型的蔗糖转化率相比,突变体V23L和V23L/S424R分别为70.7%和76.3%,高于野生型。3、结合虚拟筛选、序列比对、分子对接方法对野生型SPase进行分子改造以拓展底物谱,获得了转糖基化活性提高的突变体。基于SPase模拟结构利用虚拟饱和突变,在以D-葡萄糖和D-半乳糖为受体时,筛选出两个蔗糖转化率提高的突变体G161M和G161F。同时,通过同源序列比对构建了突变体Lm SP Q341S。在以D-葡萄糖为受体时,与野生型相比,Q341S的转糖基化活性提高18%,且产物曲二糖的产量是野生型的1.9倍。此外,还将受体底物与共价糖基酶中间体进行对接,对相互作用的氨基酸位点进行丙氨酸突变以及设计简并引物筛选,最终得到了两个转糖基化活性提高的突变体Q341A和I297L。这两个突变体在以D-葡萄糖为底物时,产物曲二糖的产量分别是野生型的2.6及1.5倍。