论文部分内容阅读
胸膜肺炎放线杆菌（.Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）,是一种有荚膜的革兰氏阴性球杆菌,它作为猪传染性胸膜肺炎的病原体,引起全球养猪业的巨大的经济损失。根据荚膜多糖的不同,迄今为止,已经发现15种血清型的胸膜肺炎放线杆菌,它们在毒力和地缘分布上呈现多样性。APP血清型的多样性给它的预防和控制工作带来了很大的困难。APP血清型的多样性在致病与免疫机制的研究以及临床和流行病学的应用方面都有很重要的意义。目前,通常用来预防APP的疫苗为全细胞灭活苗或亚单位疫苗（如外毒素ApxⅠ, ApxⅡ或ApxⅢ,外膜蛋白）。但这些疫苗只能对同源或部分异源血清型的APP有较好的免疫保护作用。虽然减毒活疫苗也有效果,但由于安全问题,减毒苗尚未被批准用于猪场。因此,新型的能够对抗多种APP血清型的保护性抗原的鉴定及评估,是非常必要的。本研究通过对APP14个血清型标准菌株的比较基因组杂交和转录谱分析,结合生物信息学预测,鉴定出39个稳定表达的保守的外膜蛋白和外膜脂蛋白,并成功表达纯化了其中12个蛋白。用动物实验对其免疫原性进行了研究。1.胸膜肺炎放线杆菌的比较基因组杂交的研究分析根据三个完全测序APP菌株（血清3型JL03株,血清5型L20株和血清7型AP76株）的全基因组序列,用生物信息学方法预测了它们的保守表面蛋白。在APPJL03株的2097个ORFs中,有501个蛋白存在于细胞表面,375个蛋白有信号肽,其中有52个蛋白预测为外膜蛋白。经过对APP L03株、L20株和AP76株的BLASTP分析,发现这三种血清型菌株之间有1851个同源基因,其中318个同源基因可能编码表面抗原（271个膜蛋白和47个脂蛋白）。根据APP JL03全基因组序列设计连续的60nt的寡核苷酸探针,采用原位合成的方法制作高密度APP基因组芯片。提取14个血清型标准菌株（测试菌株）的基因组和JL03株（参考菌株）的基因组DNA,分别用Cy5和Cy3进行标记,分别与高密度APP基因组芯片进行杂交。对芯片杂交数据进行分析,发现测试菌株与JL03株相比,差异基因的比例在2.9%-4.2%之间,并且有201个基因在至少一株测试菌株中缺失或显著差异。一些已知的与血清型多样性相关的基因位点（荚膜多糖合成基因簇、O-抗原合成基因簇、Apx毒素操纵子等）再次被确认,并发现了一些新的候选基因。在JL03株中发现了5个潜在的基因岛（GI-1,-2,-3,-4,-5）,它们可能与JL03株的血清型特异性相关。同时比较不同血清型的标准菌株和JL03株的谱系关系,将这些菌株分成了4组,即1.1（血清型2,3,4,6）,2.1（血清型5b和9）,2.2（血清型1,7,11,12）,2.3（血清型5a,8,10,13）。该研究结果对进一步揭示APP的遗传多样性奠定了基础。2.胸膜肺炎放线杆菌转录谱的比较分析选取APP上的2866个非冗余的基因,设计寡核苷酸探针,采用原位合成的方法制作APP的表达谱芯片。分别提取14个血清型标准菌株的总RNA,使用逆转录酶合成cDNA,然后再合成cRNA,用Cy3进行标记,分别与APP的表达谱芯片进行杂交,根据杂交信号进行数据分析。转录谱分析发现,656个基因在所有菌株全基因组水平稳定转录。结合比较基因组杂交和转录谱分析发现,APP中三个占主要优势的基因座（荚膜多糖合成基因簇、O-抗原合成基因簇、Apx毒素操纵子）在不同的血清型之间有较大差异,这些基因的差异直接导致APP血清型的多样性。此外,在14个APP血清型标准菌株中,有39个保守的表面蛋白基因均能稳定转录,可以作为潜在的疫苗候选靶标,对APP新型疫苗的开发具有重要指导意义。3.胸膜肺炎放线杆菌保守表面抗原的免疫原性研究根据比较基因组杂交和转录谱分析的结果,本研究从JL03株基因组中成功克隆了20个保守的表面蛋白基因到表达载体pET-28a中,并在大肠杆菌中成功表达了其中的12个,纯化获得12种重组蛋白。用小鼠模型比较研究了它们对同源血清型（血清3型JL03株）的免疫保护作用,然后,用其中3个免疫原性较好的重组蛋白APJL0126, HbpA和OmpW免疫APP的自然宿主猪,分别用JL03株和4074株（血清1型）进行攻毒试验,以测试其同源和异源免疫保护力。结果表明,这些蛋白可诱导高滴度的抗体,减轻攻毒猪的临床症状和病理变化。虽然这些重组蛋白单独免疫不能提供非常有效的免疫保护,但可以作为APP外毒素亚单位疫苗的添加组分,以提高亚单位疫苗的免疫保护效力。