流感病毒的爆发流行对人类的健康和经济造成巨大威胁。近年,美国爆发的流感病毒感染导致的死亡人数超过14000人。目前治疗流感病毒的药物疗效有限,主要包括金刚烷胺类,扎那米韦及奥司他韦。耐药流感病毒株的不断增多使得疫苗成为控制流感爆发的最有效且经济的手段。目前流感疫苗生产基质主要是鸡胚,但是鸡胚生产流感疫苗存在各种缺陷。首先,流感爆发期难以及时供应大量的鸡胚;再者,鸡胚生产的流感疫苗中残余卵清蛋白,对于卵清蛋白过敏的预防者难以应用。综上因素流感疫苗的生产基质更倾向于细胞。目前开发流感疫苗生产的细胞主要有MDCK和Vero细胞,虽然MDCK细胞对流感病毒更敏感,但是其为肿瘤细胞,能否应用仍存争议。Vero细胞是公认的安全系数较高的疫苗生产基质,以其作为流感疫苗生产的基质成为趋势。但流感病毒在Vero细胞上不敏感,需要采用流行株与Vero细胞高产适应株重配来制备生产毒种。目前Vero细胞适应株十分稀少,开展流感病毒Vero细胞适应相关基因位点研究对于采用反向遗传学制备Vero细胞流感病毒疫苗至关重要。本研究中以本实验室选育的H3N2甲型流感病毒Vero细胞适应株为研究对象。通过基因测序找到病毒适应Vero细胞前后病毒的PB1、PB2、NP、及PA四段病毒内部基因的差异位点。通过生物信息学软件DNASTAR预测基因位点的改变对蛋白二级结构的影响,经过分析筛选出要研究的基因位点,包括PB1 49、PB1 1069、PB2 407、PA 1277进行研究;针对NP片段,因其较前面三个基因片段短,选取NP 301、NP 451、NP 593、NP 647及NP 850基因位点进行探索研究。通过融合PCR技术进行基因定点突变,获得含突变位点的基因片段,然后基于同源重组方法将目的基因片段构建到pHW2000质粒上。将含有突变位点的质粒与其他七质粒共转染293T细胞后将转染72 h的上清液接种于9～11日龄鸡胚,培养72 h,收获阳性鸡胚尿囊液。拯救出的病毒通过核酸提取及测序,在确认未引入其他突变的条件下,对比拯救出的含突变位点病毒与未突变病毒在Vero细胞上增殖的差异性。通过试验对比结果发现,编码框内PB1 49、NP 593、NP 301、NP 451、NP 850、PA 1277、PB2 407位核苷酸的改变对病毒在Vero细胞上的增殖无影响。流感病毒Vero细胞适应可能涉及到更多的单基因位点或者基因的连锁突变,具体突变位点及机制仍需进一步研究。