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双特异性磷酸酶是酪氨酸蛋白磷酸酶家族中的一个新兴家族,能够使磷酸化的酪氨酸残基和丝/苏氨酸残基去磷酸化。它们在有丝分裂、信号传导、胞外刺激和细胞周期等通路中发挥重要作用。
我们从金黄色葡萄球菌基因文库中克隆了两条新的双特异性磷酸酶,命名为低分子量的双特异性磷酸酶sLMWDSP(lowmolecularweightdualspecificityphosphatase,Staphylococcusaureus)和蛋白磷酸酶sPP2C(proteinphosphatase2C,Staphylococcusaureus)。sLMWDSP具有462个碱基,编码的蛋白有154个氨基酸且具有一个双特异性磷酸酶的催化结构域。蛋白产物的分子量为18kDa,等电点为4.49。sPP2C具有741个碱基,编码的蛋白有247个氨基酸且具有一个磷酸蛋白磷酸酶2C的催化结构域。蛋白产物的分子量为26.1kDa,等电点为4.95。在E.coli.Rossetta中表达蛋白sLMWDSP、sPP2C。高纯度的sLMWDSP、sPP2C用亲和层析的方法纯化得到。
sLMWDSP和sPP2C的磷酸酶活性用对硝基苯磷酸pNPP(p-nitrophenylphosphate,pNPP)进行检测,发现sLMWDSP的最适pH是6.7,最适温度是35℃,且不依赖于金属离子;而sPP2C的最适pH是11.0,最适温度是37℃,且该酶的活性必须依赖二价的金属离子,在二价金属离子Mn2+存在下活性最高。磷酸酶的通用抑制剂岗田酸、EDTA对sLMWDSP几乎没有抑制作用,但钒酸钠能明显地抑制该酶的活性。sPP2C能被抑制剂EDTA、钒酸钠、焦磷酸钠、磷酸钠完全抑制。酶学研究表明:sLMWDSP和sPP2C对pSer/Thr、pTyr的寡肽均有去磷酸化作用,说明sLMWDSP和sPP2C是两个新的双特异性磷酸酶。