研究背景：神经干细胞是一类可以自我更新、增殖的多潜能细胞，并在一定的条件下能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。它的这一特性，使它可以代替损伤、丢失或死亡的神经元[1]，打破了中枢神经系统发育成熟后不可再生的理论。神经干细胞具有神经营养、支持和保护作用，同时能够定向诱导分化为特定的神经元，因此神经干细胞移植疗法为神经退行性疾病（如：帕金森病）的治疗提供了新的思路[2-4]。但是神经干细胞的临床应用仍存在诸多问题[5]，例如神经干细胞移植到病变区域后，分化出的所需要的特异性神经元（如：多巴胺能神经元）是否足够，以达到预期的治疗效果等。神经干细胞体外分化至多巴胺能神经元是一个十分复杂的过程，其诱导条件与分化机制目前尚未清楚。　　在哺乳类动物的中枢神经系统中存在着多种神经营养因子，它们对于维持神经元的存活、生长、发育及功能成熟等具有重要的作用[6-8]。胶质细胞源性神经营养因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF）最初被认为对多巴胺能神经元具有特异性营养活性和保护作用，而最新研究认为，它有促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用，且当浓度为10μg/L效果最好[9-10]。Ling和Carvey等[11-12]研究表明，白细胞介素1α（Interleukin-1α,IL-1α）在0.1μg/L的浓度下能诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化。目前尚未见这两种因子联合诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元的报道。　　神经干细胞的增殖、分化是一个十分复杂的过程，其中碱性螺旋-环-螺旋转录因子（basichelix-loop-helix，bHLH）在其中起着重要作用[13-14]，bHLH转录因子分为抑制型基因：Hes1(Hairyandenhancerofsplit1)等；激活型基因：Mash1（Mammalianachaete-scutehomlog1）等，两者处于动态平衡互相调控，在神经干细胞增殖和分化的调控等各方面中发挥重要作用[15-16]。Mash1基因表达于早期发育的神经系统中，有促进神经干细胞向神经元分化的作用[17-18]。Hes1基因则是在维持神经干细胞自我更新能力和抑制多潜能神经前体细胞向神经元分化和建立正常的神经元功能中起关键性的作用。　　目的：本实验分为两部分，第一部分旨在通过神经干细胞的体外培养及向多巴胺能神经元诱导分化，观察其生物学特性，了解获取高比例分化为多巴胺能神经元的条件；第二部分通过进一步研究神经干细胞分化为多巴胺能神经元过程中bHLH转录因子相关基因Mash1和Hes1的表达变化，为神经干细胞向多巴胺能神经元分化过程的机制研究奠定基础。　　方法：第一部分：无菌条件下取孕14-16天的胚胎大鼠端脑，制备成单细胞悬液，接种至增殖培养基中培养，形成神经球后传代。取第三，第四代神经干细胞进行巢蛋白（Nestin）免疫荧光检测及分化能力鉴定，并将第三，第四代神经球接种至预先用多聚赖氨酸包被的24孔板中，分为对照组（空白对照组）、实验组1（GDNF组）与实验组2（GDNF+IL-1α联合诱导组）进行诱导分化，在含5％CO2的37℃恒温培养箱内培养2周，用免疫荧光法检测β-tubulinⅢ和酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase,TH）的表达。　　第二部分：取体外培养的第三，第四代神经球，作实时荧光定量PCR检测第三，第四代神经干细胞之间Mash1与Hes1基因表达是否有差异；再将第四代神经球接种于预先用多聚赖氨酸包被的6孔培养板内，分为对照组（空白对照组）与实验组（GDNF+IL-1α联合诱导组）进行诱导分化，在含5%CO2的37℃恒温培养箱内培养，每2天半量换液1次，取分化第1周和第2周的细胞，应用荧光定量PCR技术分析其分化过程中Mash1与Hes1基因的表达变化。　　结果：第一部分：神经干细胞的体外培养获得了大量能自我增殖的神经干细胞，细胞传代培养至第三，第四代后，免疫荧光检测Nestin表达细胞阳性率为第三代93.35±3.36%，第四代93.04±3.55%，两者间比较没有统计学差异。诱导分化2周后免疫荧光检测各组β-tubulinⅢ细胞阳性率分别为：第三代，对照组（11.41±1.42%）、实验组1（22.40±1.43%）、实验组2（34.01±3.94%），各组间比较存在统计学差异；第四代，对照组（12.65±1.58%）、实验组1（23.55±2.03%）、实验组2（33.95±2.97%），各组间比较存在统计学差异；第三，第四代神经干细胞分化间比较没有统计学差异。TH细胞阳性率分别为：第三代，对照组（1.04±0.26%）、实验组1（4.56±0.77%）、实验组2（6,08±1.39%），各组间比较存在统计学差异；第四代，对照组（1.46±0.41%）、实验组1（7.99±1.15）、实验组2（15.51±1.94%），各组间比较存在统计学差异；第三，第四代神经干细胞分化间比较存在统计学差异。　　第二部分：Mash1和Hes1基因在神经干细胞分化前后均有表达。第三，第四代神经干细胞间比较显示，第四代神经干细胞的Mash1基因表达明显高于第三代神经干细胞，两者间比较存在统计学差异；而第四代神经干细胞的Hes1基因则明显低于第三代神经干细胞，两者间比较存在统计学差异。第四代神经干细胞诱导分化后，Mash1基因于分化后表达升高，实验组与对照组比较存在统计学差异，分化2周与分化1周比较存在统计学差异；Hes1基因则于分化后表达降低，实验组与对照组间比较没有统计学差异，分化2周与分化1周比较没有统计学差异。　　结论：1、GDNF和IL-1α联合作用能够诱导神经干细胞较高比例的分化为多巴胺能神经元；　　2、第四代神经干细胞分化为多巴胺能神经元的比例高于第三代神经干细胞；　　3、Mash1基因与Hes1基因可能参与神经干细胞分化为多巴胺能神经元的过程。