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帕金森病(Parkinsons disease,PD)是以中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失为特征的神经系统退行性疾病。多巴胺能神经元丢失的同时伴随着神经胶质细胞的反应性活化增生,胶质增生在不同情况下有其有利的一面,如:产生营养因子保护神经元,但也可能产生一系列不良事件,如:分泌炎症因子。与PD密切相关的胶质细胞,包括星形胶质细胞(astrocyte)和小胶质细胞(microglia),它们通过不同的途径起作用。星形胶质细胞维持神经元微环境,给予营养和代谢支持,并调节其对损伤的反应。研究发现,星形胶质细胞可发挥神经元保护作用,表现为神经元与星形胶质细胞共培养或在其条件培养基存在的情况下,可以在一定程度上得到保护,抵抗毒性物质的侵害。鱼藤酮是一种线粒体复合酶Ⅰ(complexⅠ)抑制剂,流行病学调查显示长期接触鱼藤酮会增加患PD的危险性。慢性暴露于小剂量鱼藤酮可以模拟出PD的临床症状和病理特征,尤其是能够诱导出类似Lewy体的结构,因此它成为研究帕金森病病理改变的一个有潜力的诱导剂。然而,星形胶质细胞在诸如鱼藤酮等致PD环境因素中所起作用鲜有报道。
为此,本研究采用MN9D细胞作为多巴胺能神经元细胞模型,探讨星形胶质细胞对于鱼藤酮致多巴胺能神经元损伤的保护作用及其可能保护机制。经或未经星形胶质细胞条件培养基(astrocyte conditioned medium,ACM)处理的细胞暴露于鱼藤酮,分别检测细胞活性、线粒体功能、氧化应激、抗氧化系统、凋亡信号传导通路、营养因子等指标。结果显示MN9D细胞在条件和普通培养基培养条件下生长曲线无明显差别;在不同浓度鱼藤酮作用24,48小时条件后,经ACM处理的细胞其细胞活性显著高于对照组,而小胶质细胞条件培养基(microglia conditioned medium,MCM)则未显示出保护作刚;不同浓度ACM都有保护作用,纯的ACM保护作用稍弱:预先24h加入ACM和给予鱼藤酮同时加ACM都有保护作用,鱼藤酮作用12h小时后再给予ACM则无保护作用;ACM处理的细胞在鱼藤酮刺激下线粒体肿胀度小于对照组细胞,而complexI活性高于对照组细胞;DCF染色流式细胞仪检测显示经ACM处理的细胞氧化应激水平降低,ACM提高了细胞还原型谷胱甘肽含量,缓解了鱼藤酮所致谷胱甘肽耗竭,外加谷胱甘肽可部分模拟ACM的保护作用;经ACM处理的细胞暴露于鱼藤酮后Caspase-3活性低于对照组;ELISA实验揭示NGF可能参与了ACM的保护作用,而BDNF则未参与。
基因芯片技术是一种快速、高效、准确、高通量筛选差异表达基因的方法。以上经或未经ACM处理的细胞暴露于鱼藤酮后提总RNA逆转录与AffymetrixMouse4302.0基因表达谱芯片杂交,初步得到104个差异表达基因,其中62个表达上调基因,42个表达下调基因。这些基因主要涉及信号转导、转录调节、代谢、细胞周期等多种功能。通过查阅文献及结合本研究,ATP合成酶亚单位(ATP synthase,H+ transporting,mitochondrial F1 complex,alphasubunit,isoform1,Atp5a1)、、红系核内转录因子2相关因子3(nuclear factor erythroid 2-related factor3,Nrf3)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL,glutamate cysteine ligase)、NADPH醌氧化还原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)可能与ACM保护作用有关,并且用实时定量PCR予以验证。
综上所述,星形胶质细胞条件培养基能保护MN9D细胞抵抗鱼藤酮所致的细胞损伤,保护机制有三,首先,ACM通过谷胱甘肽途径来保护细胞抵抗氧化应激损伤,其次,ACM对线粒体有一定保护作用,表现为缓解complexI活性下降以及抑制线粒体依赖的Caspase凋亡通路,最后,ACM所含诸如NGF的营养因子也起到一定保护作用。另外,Atp5al,Nrf3等基因经ACM处理后发生差异表达,可能是星形胶质细胞保护作用的部分下游信号通路。研究这些基因功能可能会有助于进一步认识星形胶质细胞保护作用,从而更加明确星形胶质细胞在PD发病过程中所扮演角色。