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铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属中一种药食兼用的草本植物,是我国传统名贵中药材,自古以来就有“药中黄金”之美誉,为中华九大仙草之首。关于它的记载已有上千年的历史,药用始载于《神农本草经》,为补阴药,具有生津益胃、滋阴清热等功效,自古以来就是中医治疗“消渴”的专用药。铁皮石斛多糖(Dendrobium officinale polysaccharide,DOP)提取自铁皮石斛干燥茎,具有显著的药理活性,是铁皮石斛中发挥药理作用的主要活性成分。现代医学研究表明DOP具有抗氧化、抗癌、抗疲劳、降血糖血脂、免疫调节及肝保护等药理作用。然而,DOP降糖作用的潜在机制尚不明确。本研究旨在探讨DOP对高脂高糖饮食小鼠糖代谢紊乱的改善作用及其具体机制。本研究以铁皮石斛为原料,提取纯化得到组分均一、纯度高的铁皮石斛多糖。体内建立高脂高糖饮食小鼠模型,体外建立胰岛素抵抗Hep G2细胞模型,通过一系列检测手段探讨DOP改善糖代谢紊乱的分子机制,为DOP的临床应用和保健品开发提供理论依据和研究基础。第一部分铁皮石斛多糖的提取、纯化与鉴定采用铁皮石斛干燥茎为原料,经水提醇沉法得到铁皮石斛粗多糖。粗多糖溶液经过反复冻融、超滤等过程得到棉花絮状精制铁皮石斛多糖。采用硫酸-苯酚法测定其糖含量为98.96%;HPGPC法测定其重均分子量为3.6×105 Da;紫外扫描图谱显示铁皮石斛多糖中几乎不含核酸和蛋白质;PMP柱前衍生HPLC法分析铁皮石斛多糖的单糖组成,其单糖组成之比为甘露糖:葡萄糖=4.06:1.00。该部分实验证明提取纯化得到的铁皮石斛多糖分子量均一、纯度高、几乎不含杂质;实验易于重复,结果稳定,提取的铁皮石斛多糖可用于后续药理学研究。第二部分铁皮石斛多糖改善高脂高糖饮食小鼠糖代谢紊乱的作用研究采用高脂高糖饲料喂养造成BALB/c小鼠糖脂代谢紊乱并伴有胰岛素抵抗,与人类T2DM早期症状相似,且符合人类因膳食结构改变而发病的过程和机制。之后采用低、中、高剂量的DOP灌胃治疗四周。实验中定期监测小鼠体重和空腹血糖(FBG);处死小鼠前进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT);检测小鼠肝指数、血清胰岛素含量和肝脏TG含量;制作肝脏组织H&E染色及油红O染色切片。实验结果表明,DOP灌胃治疗四周后,高脂高糖饮食小鼠的空腹血糖显著降低。同时,OGTT试验证实DOP能够显著提高高脂高糖饮食小鼠对葡萄糖的耐受力。并且,DOP给药组小鼠血清胰岛素水平显著上升,胰岛素抵抗评价指数(HOMA-IR)显著降低以及胰岛素敏感指数(ISI)显著升高,表明DOP能够促进高脂高糖饮食小鼠胰岛素的分泌,缓解胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性。此外,DOP能够显著降低高脂高糖饮食小鼠肝指数及肝脏TG水平。H&E染色和油红O染色切片显示高脂高糖饮食小鼠肝脏有严重的脂肪变性及脂肪堆积现象,同样,DOP能够显著改善上述情况。本部分实验证明DOP具有显著的降血糖、提高葡萄糖耐量、缓解胰岛素抵抗以及改善肝脏脂肪变性及脂肪堆积的功效。第三部分铁皮石斛多糖改善高脂高糖饮食小鼠糖代谢紊乱的机制研究从糖原合成和葡萄糖代谢两大方面探讨DOP改善高脂高糖饮食小鼠糖代谢紊乱的分子机制。我们检测了小鼠肝糖原含量;检测小鼠肝脏PK、HK和PEPCK活力;WB法检测小鼠肝脏糖原合成相关蛋白p-GSK-3β、GSK-3β、p-GS和GS,HIF-1α及其上游分子m TOR,PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-IR-β、IR-β、p-IRS1、IRS1、p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt的蛋白表达水平;RT-PCR法检测小鼠肝脏HIF-1α、GLUT1、HK-2、IR-β、PTK和PTP 1B的m RNA水平。实验结果显示,DOP能够显著提高高脂高糖饮食小鼠肝糖原含量,并显著抑制糖原合成激酶GSK-3β活性,提高糖原合成酶GS活性。另一方面,DOP能够显著提高高脂高糖饮食小鼠肝脏PK、HK活力,加快糖酵解,并且显著降低PEPCK活力,抑制糖异生。此外,DOP显著提高高脂高糖饮食小鼠肝脏缺氧诱导因子HIF-1α的蛋白表达水平及m RNA水平,增加下游靶基因GLUT1和HK-2的转录,促进糖酵解。WB法检测小鼠肝脏PI3K/Akt信号通路相关蛋白,结果显示DOP可显著上调通路相关蛋白的表达量,表明DOP能够刺激高脂高糖饮食小鼠肝脏PI3K/Akt信号通路,从而发挥调节糖代谢紊乱作用。另外,我们发现高脂高糖饮食小鼠肝脏PTK的m RNA水平显著降低,而PTP 1B的m RNA水平显著升高,铁皮石斛多糖给药四周后,PTK的m RNA水平显著提高,而PTP 1B的m RNA水平显著降低。这一发现提示我们DOP提高胰岛素受体磷酸化水平的作用可能与调控PTK和PTP 1B的m RNA水平有关,进一步机制有待研究。本部分实验证明DOP能够刺激高脂高糖饮食小鼠肝脏的PI3K/Akt信号通路,调控下游GSK-3β、PK、HK、PEPCK和HIF-1α等分子,促进糖原合成、加快糖酵解以及抑制糖异生,从而降低血糖,改善糖代谢紊乱。第四部分体外探讨铁皮石斛多糖对PI3K/Akt信号通路的调控作用为进一步明确DOP对PI3K/Akt信号通路的激活作用,我们建立胰岛素抵抗Hep G2细胞模型,并用DOP干预培养。DOP介入后,细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达量均显著上调,而PI3K抑制剂LY294002可抵消DOP的这一作用,再次证实DOP可上调PI3K/Akt信号通路。