中国是柑橘属植物最重要的起源地,具有丰富的柑橘资源。有关我国柑橘资源的研究虽然经历了半个多世纪,但对地方柑橘品种多甲氧基黄酮的研究仍缺乏相对应的研究支持。多甲氧基黄酮是柑橘类水果特有的一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗心血管疾病、抗癌等众多生物活性功能。此外,较黄烷酮相比多甲氧基黄酮良好的口服吸收利用率,使得多甲氧基黄酮有着更好的临床研究潜力。但是由于同分异构现象明显,多甲氧基黄酮单体的制备普遍存在分离方法繁琐、纯化效率不高、制备过程环境污染等问题。因此,弄清我国地方特有柑橘品种中多甲氧基黄酮的种类与含量,建立绿色、高效的多甲氧基黄酮制备方法,是未来研究柑橘属植物多甲氧基黄酮与地方柑橘资源科学利用亟需解决的关键问题。疲劳使机体处于亚健康状态,会导致机体免疫力下降、扰乱内分泌与神经系统稳定、诱发心脑血管等疾病,严重危害人们的健康。线粒体是机体能量供应的主要细胞器,也是活性氧产生的主要场所。其功能的改善不仅可以增加组织能量的供应,还能够增加组织氧化耐受能力,线粒体已成为抗疲劳研究的重要靶向细胞器。近期的研究发现,天然酚类化合物能够通过激活肌肉组织中某些蛋白的表达,改善肌肉线粒体的功能拮抗疲劳的发生,但是却尚未见到多甲氧基黄酮方面的研究报道。实验室近期研究结果发现,柑橘果皮多甲氧基黄酮混合物具有调节能量代谢的功能,提示多甲氧基黄酮单体可能具有改善线粒体活性的功效。基于相关文献信息与团队前期研究成果,本课题提出科学假设:柑橘多甲氧基黄酮单体能够通过调节线粒体活性,改善骨骼肌功能,进而对抗疲劳的发生。研究目的:1)通过分析我国十三种地方特有柑橘品种果皮中多甲氧基黄酮的组分与含量,为地方柑橘资源的利用提供新的科学信息,为多甲氧基黄酮单体原材料的选择提供实验证据;2)通过建立绿色、高效的柑橘果皮多甲氧基黄酮分离纯化方法,为柑橘果皮的科学利用开辟新的途径,为柑橘多甲氧基黄酮单体的规模化生产提供借鉴与指导;3)通过对柑橘果皮主要多甲氧基黄酮单体进行体外筛选及其体内药效学验证,为多甲氧基黄酮单体的功效研究提供新的作用靶点,为多甲氧基黄酮单体拮抗疲劳提供新的实验证据。研究方法与结果:1.我国十三种地方特有柑橘品种多甲氧基黄酮组分与含量的检测分析方法:通过超高效液相色谱结合二极管阵列检测法,对我国十三种地方特有柑橘材料（包含宽皮柑橘类、橙类、柚类、柠檬类以及枸橼五大柑橘品种）果皮中的多甲氧基黄酮组分以及含量进行检测与分析。结果:组分方面,年橘、汕头蕉柑、岩溪晚芦以及大红袍红橘多甲氧基黄酮（PMFs）含量最为丰富,包含了标准曲线中所有的PMFs成分;S26锦橙、广西凭祥土柠檬、黎檬次之含有8种PMFs成分;含量方面,大红袍红橘在所有材料中PMFs含量最高为283.40±13.20（mg/100g FW）,紧随其后分别是岩溪晚芦233.40±9.74（mg/100g FW）、汕头蕉柑222.35±20.65（mg/100g FW）、年橘191.64±29.60（mg/100g FW）、黎檬69.30±8.02（mg/100g FW）;黄烷酮方面,组分与含量位居前列的分别是黎檬778.00±22.54（mg/100g FW）、大红袍617.93±82.04（mg/100g FW）、改良橙585.10±115.67（mg/100g FW）、岩溪晚芦517.42±28.15（mg/100g FW）以及奉节脐橙464.01±53.93（mg/100g FW）。2.大红袍红橘果皮中多甲氧基黄酮单体的分离纯化与鉴定方法:通过大孔树脂结合质谱引导的制备液相同步制备多个多甲氧基黄酮单体,运用超高效液相色谱、质谱、紫外以及核磁共振对单体成分进行分析与鉴定。结果:7种常用类黄酮吸附树脂中,HPD 100型树脂吸附和解吸附能力最好,能够快速吸附与解吸附红橘果皮中的PMFs。通过机制探究发现,HPD 100对PMFs的吸附符合准二级动力学模型以及颗粒扩散一阶模型,吸附机理主要是PMFs从液膜边界转移到HPD 100表面,后PMFs与HPD 100之间发生电子转移实现吸附。吸附过程属于放热过程,符合Langmuir热力学模型,降温有利于PMFs的吸附。通过优化HPD 100动态吸附过程中的关键条件（上样浓度、过柱流速、洗脱液浓度、洗脱流速）发现,PMFs上样浓度为8.5 mg/mL,过柱流速在4 BV/h时HPD 100的吸附效果最好,而90%乙醇洗脱液浓度,4.0 BV/h洗脱流速能够有效的提高洗脱效率。经过HPD 100吸附后,粗提液PMFs的浓度提高了11.43倍。结合质谱引导的制备液相,分离纯化得到五种PMFs单体化合物。经鉴定发现这五种单体分别是:甜橙黄酮C₂₀H₂₀O₇,分子量372.12,纯度为97.4%;5,6,7,4’-四甲氧基黄酮C₁₉H₁₈O₆,分子量342.11,纯度为95.6%;川陈皮素C₂₁H₂₂O₈,分子量402.13,纯度为99.1%;橘皮素C₂₀H₂₀O₇,分子量372.12,纯度为98.64%;5-羟基-6,7,8,3’,4’-五甲氧基黄酮C₂₀H₂₀O₈,分子量388.11,纯度为97.8%。3.大红袍红橘多甲氧基黄酮抗疲劳体外单体筛选及其体内药效学验证方法:通过体外建立C2C12肌管细胞模型,对五种PMFs单体的细胞活力影响与线粒体调节活性进行研究与筛选,并对筛选出的单体进行再验证以及机制探讨。随后结合体内动物实验,通过行为学考察、生化指标检测、超微组织形态观察等全面评价、研究多甲氧基黄酮单体在体内拮抗疲劳的效果以及作用机制。结果:C2C12肌元细胞经马血清诱导分化,在第6天具备成熟肌管细胞基本形态结构。肌细胞成熟标志物肌球重链蛋白与肌细胞生成素蛋白均高表达,提示C2C12肌管细胞模型构建成功。细胞增殖与毒性检测结果显示,川陈皮素、甜橙黄酮、橘皮素、5-羟基-6,7,8,3’,4’-五甲氧基黄酮在0-200μmol/L浓度范围内（6 h）,对C2C12肌管细胞活性没有显著的抑制作用。5,6,7,4’-四甲氧基黄酮在100μmol/L浓度范围内时,对C2C12肌管细胞活性没有抑制作用。实时荧光定量Q-PCR结果显示:川陈皮素和橘皮素均具有上调线粒体生物发生关键基因TFAM以及线粒体新生生物标记物mtDNA的活性功能,其中橘皮素的调节功能更为显著。通过机制研究发现,橘皮素可能通过能量调节方式,增加了LKB1激酶Ser428位点的磷酸化,进而激活了线粒体生物发生AMPK-PGC1-α-NRF1-TFAM信号通路,发挥调节线粒体生物发生的活性功能。体内动物实验结果显示:橘皮素预防性给药4周后显著增加了小鼠悬杠时间、转棒疲劳时间。增加了小鼠肌肉糖原的含量,降低了血乳酸的水平。透射电镜结果显示,小鼠肌肉线粒体数量和体积显著增加。免疫印记与免疫组化结果也进一步揭示,小鼠肌肉线粒体生物发生信号通路被激活。研究结论:1)宽皮柑橘类柑橘品种多甲氧基黄酮的种类最为丰富且含量最高,其中大红袍红橘总多甲氧基黄酮含量在本次所选材料中居首为283.40±13.20（100 mg/g FW）,是开发多甲氧基黄酮较为理想的研究材料;2)大孔树脂HPD 100结合质谱引导的制备液能够绿色、高效分离纯化大红袍红橘果皮中的多甲氧基黄酮单体,经过鉴定这五种主要多甲氧基黄酮单体分别是甜橙黄酮、5,6,7,4’-四甲氧基黄酮、川陈皮素、橘皮素以及5-羟基-6,7,8,3’,4’-五甲氧基黄酮,纯度均高于95%;3)多甲氧基黄酮单体橘皮素能够激活肌肉AMPK-PGC1-α-NRF1-TFAM信号轴,提高骨骼肌线粒体生物发生,改善身体表现拮抗疲劳的发生。