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壳寡糖具有丰富的生理活性,在食品、农业、医药、化妆品等领域具有广泛应用前景。壳寡糖的主流制备工艺是壳聚糖的酶法水解,但酶活力高、稳定性好、成本低廉的定向催化壳聚糖的酶的挖掘不足,影响了壳寡糖产业的发展。本课题旨在利用基因克隆表达技术获得具有特定聚合度产物的高酶活、稳定性好的壳聚糖酶,并研究壳寡糖的制备工艺。首先,从解淀粉芽孢杆菌ECU08中克隆得到了全长为843 bp的新型壳聚糖酶基因,在大肠杆菌中成功表达后的重组酶分子量为31 kDa,经Ni-IDA亲和层析一步纯化得到的电泳级纯酶比活力为1031.2 U/mg,酶的最适温度为50℃,最适pH为6.0。水解特性研究表明,该酶是一种内切型壳聚糖酶,最小水解底物为壳四糖,壳聚糖水解终产物为壳二糖和壳三糖,没有单糖产生。通过控制加酶量和反应时间,能够获得DP 2-10范围内不同聚合度的壳寡糖。其次,构建了毕赤酵母高效表达体系,将上述筛选得到的壳聚糖酶基因去除信号肽后,在Pichia pastoris GS115中高效表达,经分批—补料培养的方式高密度发酵高效表达重组壳聚糖酶,在pH 5.5、50℃条件下,发酵液上清的体积酶活达到4314.0 U/mL。高密度发酵后蛋白表达量为4.2 g/L,菌体湿重为355 g/L。该酶的最适温度为55℃,最适pH为6.5,稳定性较好。发酵液-上清经Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱纯化得到的纯酶,在最适条件下的比活力为2380.5 U/mg,回收率为64.9%,纯化倍数为1.03。最后,研究了 pH、温度、底物浓度和反应时间对壳寡糖制备效果的影响,确定了壳寡糖制备的工艺路线,并进行了壳寡糖制备的放大试验。在pH为5.0,反应温度为45℃,底物浓度为3%,反应24 h时,以DP 2-3为主的壳寡糖产品制备效果最佳,产物主要为壳二糖和壳三糖,以及少量的乙酰化的壳三糖。进行30 L规模放大试验,结果表明,该工艺的生产收率和反应收率分别为75.8%和85.1%。物料衡算和经济核算表明,该工艺收益较高,适用于工业化生产。本课题获得了具有稳定性高、特异性好的新型壳聚糖酶,产物聚合度明确,并通过毕赤酵母表达系统高密度发酵批量制备重组蛋白,实现高效酶法制备以壳二糖和壳三糖为主的壳寡糖产品。