冬凌草(Isodon rubescens)为唇形科香茶菜属多年生草本植物,传统用药部位为干燥地上部分,常用于治疗咽喉肿痛、慢性肝炎、关节风湿痛、气管炎等疾病。近年来,由于其较好的抗癌活性备受关注。其主要的抗癌活性物质为冬凌草甲素、冬凌草乙素等成分,属于对映贝壳杉烷型类二萜化合物。传统的以原植物为基础的生产模式大大限制了其推广使用,以合成生物学的手段来生产药用活性成分的方法有望打破这种限制,但这种方法必须以明确化合物在植物体内的代谢途径为前提。本研究综合利用转录组、表达谱、蛋白体外功能鉴定、同源建模及定点突变等技术系统克隆鉴定了参与冬凌草甲、乙素等二萜类化合物生物合成的二萜合酶基因。发现冬凌草存在扩张的类贝壳杉烷合酶基因家族,并借此阐明了唇形科中特殊结构类贝壳杉烷合酶的进化历程。同时在冬凌草中发现了首例由可变剪切引起二萜合酶产物变化的证据,为二萜化合物多样性进化提供了新的视角。主要研究内容和结论如下:1.通过对冬凌草叶片组织的转录组测序、数据分析,共筛选到11个候选二萜合酶基因,进一步利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了这些基因的cDNA全长。对基因的开放阅读框进行分析,获得了相应编码蛋白的氨基酸数目,分子量,等电点及转运肽等信息。同时,按保守序列分类,IrCPS1、IrCPS2、IrCPS3、IrCPS4、IrCPS5包含“DXDD”序列,属于II型萜类合酶;IrKSL1、IrKSL2、IrKSL3、IrKSL4、IrKSL5和IrKSL6包含“DDXXD”序列,属于I型萜类合酶。蛋白三级结构同源建模分析进一步证明了这一点。系统发育树分析进一步明确了各个蛋白可能的生化功能。蛋白功能预测如下:IrCPS1、IrCPS2催化GGPP产生normal-CPP,IrCPS4、IrCPS5催化GGPP产生ent-CPP,IrCPS3由于氨基酸保守位点突变,没有生化功能。IrKSL1、IrKSL3、IrKSL6可以催化normal-CPP,IrKSL2、IrKSL4、IrKSL5可以催化ent-CPP。组织特异表达分析发现,IrCPS1和IrKSL1两个基因主要在根中表达,可能负责根中松香烷型二萜化合物的生物合成;相反IrCPS4,IrKSL2和IrKSL4主要在叶中表达,可能在冬凌草甲素等对映贝壳杉烷型活性物质的生物合成中起重要作用;IrCPS3在各组织中的相对表达量都很低,推测没有生化功能。2.利用原核表达系统对5个II型二萜合酶进行诱导表达,利用亲和吸附法纯化表达的目的蛋白,利用体外酶促反应及气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)鉴定其催化产物。结果发现,IrCPS1,IrCPS2可以催化GGPP生成normal-CPP,IrCPS4,IrCPS5可以催化GGPP生成ent-CPP,IrCPS3没有生化活性。这一结果与利用生物信息学方法及进化树聚类分析对这五个II型二萜合酶的功能预测结果一致。在II型二萜合酶中,“DXDD”被认为是起始GGPP成环的关键位点。所以,我们利用定点突变技术对IrCPS3的保守位点进行了回复突变,使“DXND”转变成“DXDD”。但体外酶促反应发现,该突变体IrCPS3-N333D仍然不能催化GGPP生成产物。因此,我们推测,在“DXDD”之外还有其他关键位点发生突变使IrCPS3失去了功能。3.利用原核表达系统对6个I型二萜合酶基因进行诱导表达,利用亲和吸附法纯化表达的目的蛋白,利用体外酶促反应及GC-MS鉴定其催化产物。结果显示,IrKSL1和IrKSL3可以催化normal-CPP生成次丹参酮二烯,IrKSL6催化normal-CPP生成isopimaradiene。IrKSL5与AtKS的功能一样,可以催化ent-CPP生成ent-kaurene。IrKSL4催化ent-CPP除了生成微量的ent-kaurene外,其主要产物为ent-atiserene。IrKSL2催化ent-CPP产物的保留时间与isopimaradiene一致,质谱离子碎片高度相似,但isopimaradiene与IrKSL2的11位及20位的C原子构象相反,所以,推测这两个物质互为同分异构体,需要进一步的结构鉴定来确定IrKSL2产物的绝对构象。IrKSL6虽然能分别催化normal-CPP与ent-CPP形成不同产物,但酶促动力学试验显示,IrKSL6对底物normal-CPP的亲和性显著高于ent-CPP。Kcat/Km表明,IrKSL6催化normal-CPP的效率是ent-CPP的1127倍左右。4.利用同一对引物从冬凌草叶片cDNA中克隆获得两个基因IrKSL3和IrKSL3a。序列比对发现,这两个基因只有一段18个碱基的差异,编码六个氨基酸“ILTHYR”,其他序列完全一致。进一步对其基因组序列分析发现这两个cDNA来源于基因组中的同一个基因,是通过不同的3’剪接位点发生可变剪切产生的。功能研究发现,IrKSL3a除了可以产生少量的IrKSL3的产物次丹参酮二烯,还能产生更主要的化合物isopimaradiene。通过定点突变和蛋白质三维结构同源建模发现这两个可变剪切体功能差异可能是由氨基酸数目的变化造成E螺旋下端的色氨酸位置发生变化所引起的。本研究通过克隆冬凌草中的二萜合酶基因并对其进行功能鉴定,明确了冬凌草中二萜类化合物生物代谢途径下游最初的两步反应,为下游CYP450基因的功能研究及最终阐明冬凌草整个二萜代谢网络打下重要基础。