论文部分内容阅读
食源性肽WY、WJ是以食物来源的蛋白质(鱼类蛋白和禽类蛋白)为反应底物经蛋白酶酶解制得肽产物。5-氟尿嘧啶为临床常用的抗代谢类肿瘤治疗药物,因其代谢转化为5-氟脱氧尿嘧啶核甘酸,抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,从而抑制肿瘤细胞DNA复制合成,造成DNA损伤,从而发挥抗肿瘤作用,该过程同样会作用于正常细胞,如抑制成纤维细胞的增殖和胶原的合成,延迟伤口愈合。H2O2是一种重要的活性氧,极易透过细胞膜,与细胞内铁离子通过Fenton反应形成高活性的自由基,作用于生物大分子,破坏细胞结构,最终导致诸如动脉粥样硬化、糖尿病、炎症、癌症等的发生。本文采用MTT法、单细胞凝胶电泳及流式细胞仪等技术手段,研究食源性肽WY、WJ对抗5-氟尿嘧啶的细胞毒作用及其抗H202诱导的细胞氧化应激损伤的作用,主要研究结论归纳如下：1、利用70%乙醇将食源性肽WY分离为醇溶部分WY-1,沉淀部分WY-2；将食源性肽WJ分为醇溶部分WJ-1,沉淀部分WJ-2。采用葡聚糖凝胶色谱法分别测定WY, WY-1, WY-2, WJ, WJ-1, WJ-2的分子量分布。结果表明,WY和WY-2主要是分子量大于2000Da的活性肽,WY-1主要是分子量小于2000Da的成分,且分子量小于245.611Da的成分占54.4%。WJ和WJ-1均是分子量为240Da左右的小肽,WJ-2其主要组成部分为分子量是400Da的组分,含量约占70%。2、采用氨基酸分析仪测定WY, WY-1, WY-2, WJ, WJ-1, WJ-2的氨基酸组成,氨基酸测定结果表明WY, WY-1, WY-2均含有丰富的谷氨酸和甘氨酸。氨基酸测定结果表明,WJ主要含有谷氨酸、甘氨酸；WJ-1主要含有天门冬氨酸、甘氨酸；WJ-2主要含有亮氨酸、甘氨酸。3、采用MTT法研究以上各组分对HSF细胞增殖作用,通过比较WY、 WY-1和WY-2对HSF细胞72h增殖作用影响,发现WY-2的促增殖作用明显高于WY、WY-1和肌肽,而WY和WY-2的效果和肌肽没有明显差别。在此基础上继续研究WY-2对HSF细胞生长曲线的影响,结果表明WY-2可促进HSF细胞的增殖作用,且在对数期对其增值作用最为明显,平稳期增殖作用逐渐减弱,并没有改变HSF细胞自然的生长规律。4、通过比较不同浓度的WJ、WJ-1和WJ-2对HSF细胞72h增殖作用影响,发现WJ-1的促增殖作用明显高于WJ-2和肌肽,而WJ-2的效果和肌肽没有明显差别,说明食源性肽WJ的活性成分是分子量大约为230Da作用的小肽。根据筛选出来的结果,在此基础上继续研究WJ-1对HSF细胞生长曲线的影响,结果表明WJ-1促进HSF细胞的增殖作用,且在对数期对其增值作用最为明显,平稳期增殖作用逐渐减弱,并没有改变HSF细胞自然的生长规律。5、采用MTT法研究食源性肽WY、WY-1、WY-2、WJ、WJ-1、WJ-2对5-FU诱导的HSF细胞增殖抑制的影响。结果表明以上样品作用浓度范围内对HSF细胞均无毒害作用,均能抵抗5-FU诱导的HSF细胞增殖抑制,但在不同剂量5-FU、不同孵育时间、不同样品浓度时,不同样品表现出的保护作用不同,保护程度也有差异。其中,WY-2和WJ-1受这些因素影响较小,有较强较广泛的保护作用,但具体的保护机制及作用规律有待于进一步探讨。6、利用MTT法和单细胞凝胶电泳法研究不同浓度的5-FU对HSF细胞增殖作用和DNA损伤的影响,结果发现100μg/mL的5-FU作用HSF细胞24h,细胞存活率在80%以上,而细胞DNA损伤率已达98.09%,从而建立了体外5-FU诱导HSF细胞DNA损伤的模型平台。单细胞凝胶电泳实验表明,食源性肽WY和WJ组细胞彗星尾长,尾矩,Olive尾距和尾部DNA百分含量与5-FU组比较明显减少,WY, WJ均可有效地减少5-FU引起的HSF细胞DNA的断裂损伤。体外实验表明食源性肽WY和WJ可以有效对抗细胞DNA损伤,其作用机理还有待于进一步的研究。7、对HSF细胞进行形态学观察,运用MTT法测定细胞活性,确定了HSF细胞达半数致死率时的H2O2浓度(500μmol/L),从而建立了体外过氧化氢诱导HSF细胞氧化应激损伤模型平台。在此基础上进一步研究食源性肽WY和WJ对高剂量短时间H202作用诱导HSF细胞氧化应激损伤的保护作用。结果表明,WY-2的对HSF细胞的保护作用强于WY和WY-1, WJ-1对HSF细胞的保护作用要强于WJ和WJ-1。8、采用MTT法研究WY-2, WJ-1,及其配伍作用对低剂量长时间H2O2(10μmol/L)作用诱导HSF细胞氧化应激损伤的保护作用。结果表明,WY-2, WJ-1分别对过氧化氢诱导HSF细胞氧化应激损伤均有保护作用,且呈剂量依赖性。WY-2和WJ-1配伍后,可能是其成分相互影响的原因,保护作用要强于它们单独作用,说明WY-2和WJ-1具有协同作用。9、采用MTT法研究WY、WY-1、WY-2、WJ、WJ-1、WJ-2对H22细胞的抑制作用的影响。结果表明,不同浓度食源性肽作用H2248h均能显著性的抑制H22的生长。250μg/mL的WY, WY-1和WY-2对H22的抑制率分别为21.6%,27.9%和34.2%。在50μg/mL的作用浓度下WJ, WJ-2和肌肽对H22的抑制作用最强,抑制率分别为24.6%,23%和13.1%,WJ-1在250μg/mL作用浓度下对H22的抑制率达到29.4%。WY-2与5-FU, WJ-1与5-FU也具有协同作用,但是协同作用并不明显,WY-2与WJ-1配伍后虽没有协同5-FU抗癌作用,但不影响其抗肿瘤作用。10、采用流式细胞仪技术研究食源性肽WY-2、WJ-1及其配伍对H22细胞周期的影响。流式细胞仪测定结果表明,不同浓度的WY-2可诱导H22细胞在G0/G1期积蓄,但不能促进其S期的积蓄；250μg/mL的WJ-1、50-250μg/mL范围内的WY-2+WJ-1和10-250μg/mL范围内的肌肽均能使S期的H22细胞数均明显升高,G0/G1期细胞减少；说明它们均可诱导H22细胞S期的积蓄,有助于提高S期时特异性化疗药物的敏感性。