论文部分内容阅读
目的通过观察清肠化湿方对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎模型大鼠的治疗效果,以NF-κB为中心分别探讨其抑制NF-κB过度活化,减少肠黏膜促炎细胞因子分泌,保护肠上皮紧密连接(tight junction, TJ)蛋白,减少树状突细胞(dendritic cells, DCs)数目并抑制其活化程度,以及抑制细胞间黏附分子ICAM-1表达的疗效机制,为临床用药提供客观依据,为开发治疗UC的中药新药打下科学基础。方法将40只雄性清洁型Wistar大鼠,体重(200±20)g,6-7w鼠龄,随机分为四组,每组10只；空白对照组,常规饲养,自由饮水进食。采用TNBS造模后分为模型对照组：造模后每日给予等体积生理盐水灌胃。清肠化湿方组：按成人10倍剂量(12.8g生药.kg-1.d)一次性灌胃给药。美沙拉嗪组,按按成人10倍剂量(0.67g.kg-1.d)一次性灌胃给药；于造模后第2天给药,连续10d。最后1次给药后,禁食24h处死大鼠,留取新鲜结肠标本和肠系膜淋巴结组织,观察各组大鼠一般情况和结肠组织病理形态：ELISA法检测肠黏膜组织促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平；免疫组化法检测结肠黏膜组织和MLN DCs数目,流式细胞仪检测肠系膜淋巴结大鼠DC特异标志分子OX-62百分比和DCs表面分子MHC-Ⅱ和CD86的表达；免疫组化法检测大鼠结肠粘膜ICAM-1的表达情况,ELISA法检测sICAM-1水平；免疫组化SP法检测大鼠结肠粘膜上皮occludin、 claudin-1蛋白的表达,实时荧光定量PCR (real-time PCR)方法检测结肠黏膜组织(?) occludin mRNA、claudin-1mRNA表达情况；(?)eal-time PCR法检测NF-κBp65mRNA的表达水平,免疫组化SP法和蛋白免疫印迹法检测大鼠结肠粘膜NF-κB p65的表达水平；采用相关分析探讨NF-κB p65与炎性积分、IL-1β, TNF-α, IL-6, Claudin-1、occludin, DCs, ICAM-1等指标的相关性。结果造模后,模型组大鼠比空白组大鼠结肠黏膜的病理炎性积分明显升高(P<0.01)；促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平明显升高(P<0.01)；结肠粘膜DCs和MLNDCs计数明显增多(P<0.01),MLN DCs表面分子MHC-Ⅱ表达水平明显增高(P<0.01)；ICAM-1和sIC AM-1水平明显增高(P<0.01)；occludin mRNA、claudin-1mRNA, occludin、 claudin-1蛋白表达水平下降(P<0.05)；NF-κB p65mRNA和NF-κB p65蛋白表达水平增高(P<0.05)。经清肠化湿方和美沙拉嗪治疗后,病理炎性积分明显降低(P<0.01)；IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平明显降低(P<0.01)；结肠粘膜DCs和MLN DCs计数明显减少(P<0.01),MLN DCs表面分子MHC-Ⅱ表达水平明显降低(P<0.01)；ICAM-1和sICAM-1水平明显降低(P<0.01);occludin mRNA、claudin-1mRNA, occludin、claudin-1蛋白表达水平下降(P<0.05);NF-κB p65mRNA和NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)。NF-κB p65与炎性积分、IL-1β, TNF-α, IL-6, Claudin-1、occludin, DCs, ICAM-1等指标呈高度相关(P<0.01)。治疗前后各组大鼠MLN DCs的比例和其表面分子CD86表达水平无统计学差异(P>0.05)；清肠化湿方和美沙拉嗪对大鼠各观察指标的影响无统计学差异(P>0.05)。结论清肠化湿方可以改善TNBS模型大鼠结肠的一般情况和炎症病变,其机制与其可以抑制结肠黏膜NF-κB的表达,从而降低促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌水平,减少结肠黏膜及MLN DCs的数目,抑制DCs的活化,降低结肠黏膜黏附分子ICAM-1的表达水平,增加UC结肠黏膜紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin的表达,恢复肠粘膜屏障功能等有关。