【摘 要】
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补体系统在抵御病原体的入侵、炎症的发生和维持机体动态平衡等方面发挥着重要作用。补体系统主要通过经典途径（CP）、凝集素途径（LP）和替代途径（AP）激活,进而形成机体自我保护的天然屏障。为了能在宿主体内生存繁殖,病原菌进化出了一系列逃逸补体杀伤的机制,这些补体逃逸的机制包括捕获补体调控因子、切割补体组分和产生补体抑制因子等。鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是一
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补体系统在抵御病原体的入侵、炎症的发生和维持机体动态平衡等方面发挥着重要作用。补体系统主要通过经典途径（CP）、凝集素途径（LP）和替代途径（AP）激活,进而形成机体自我保护的天然屏障。为了能在宿主体内生存繁殖,病原菌进化出了一系列逃逸补体杀伤的机制,这些补体逃逸的机制包括捕获补体调控因子、切割补体组分和产生补体抑制因子等。鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是一种主要引起雏鸭的急性、接触性、败血性传染病的病原菌,同时也能感染鹅、火鸡及其他禽类。由于该病发病率和死亡率较高,严重制约着我国规模化鸭场的发展。课题组前期研究发现,鸭疫里氏杆菌的T9SS分泌系统分泌的蛋白与补体抗性有关,并且鸭疫里氏杆菌可以通过替代途径逃逸补体灭活。通过细菌的外膜蛋白结合补体调控因子H（Factor H,FH）,阻断替代途径的激活是致病菌普遍使用的逃逸机制,但RA通过补体因子H引发免疫逃逸的机制尚不清楚。因此,本课题开展了与鸭补体因子H互作的鸭疫里氏杆菌蛋白的筛选与鉴定的研究,以期发现与H因子互作的外膜蛋白。首先以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的鸭补体因子H为诱饵蛋白,通过Pull-down试验筛选互作的鸭疫里氏杆菌外膜蛋白,经过质谱测序分析,ELISA试验及Pull-down试验验证外膜蛋白与鸭补体因子H的相互作用。本研究取得的结果如下:1.鸭补体因子H结构域FH1-7SCRs和FH8-20SCRs的真核表达与纯化提取新鲜鸭肝mRNA并反转录为cDNA,以此为模板分别扩增出FH1-7SCRs和FH8-20SCRs片段,利用重叠PCR与strep-tag融合,经测序正确后连接至真核表达载体p Fast Bac TM1,转化DH10Bac感受态。挑取阳性菌落经过连续三代蓝白斑筛选,构建了真核表达载体p Fast Bac TM1-FH1-7和p Fast Bac TM1-FH8-20。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行蛋白的表达与纯化。经SDS-PAGE电泳检测,结果显示分别在51KD和大于100KD处出现特异性条带,经过Western blot检测,证实鸭补体因子H的FH1-7SCRs和FH8-20SCRs在昆虫细胞Sf9中成功表达,并且FH8-20SCRs蛋白比预期结果略大,表明在蛋白的表达过程中存在糖基化的蛋白修饰。2.与鸭补体因子H FH1-7SCRs和FH8-20SCRs互作的鸭疫里氏杆菌云梦株（RA-YM）外膜蛋白的筛选复苏鸭疫里氏杆菌云梦株RA-YM,采用SLS（十二烷基肌氨酸钠）法提取外膜蛋白。分别以蛋白FH1-7SCRs和FH8-20SCRs为诱饵蛋白通过Pull-down试验钓取互作的外膜蛋白,互作蛋白经质谱测序后,结果分析显示:空白组中不存在或者试验组与空白组存在显著差异的蛋白共62个,其中能同时与FH1-7SCRs和FH8-20SCRs互作的蛋白25个,仅与FH1-7SCRs互作的蛋白有27个,仅与FH8-20SCRs互作的蛋白10个。经过功能性分析,选取可能同时与FH1-7SCRs和FH8-20SCRs互作的10个蛋白,即sec A、T9SS、HP、Ton B、Psp C、Du F、AS、Co A、Tuf、Rse P进行后续试验验证。3.外膜蛋白Tuf与鸭补体因子H互作的验证分别克隆10个候选蛋白基因[sec A（3072bp）、T9SS（2235bp）、HP（2322bp）、Ton B（2081bp）、Psp C（1680bp）、Du F（1734bp）、AS（1818bp）、Co A（1758bp）、Tuf（1188bp）和Rse P（1332bp）],经测序正确后,双酶切连接到p ET-32a表达载体上,构建了10个原核表达载体,在宿主菌E.coli BL21中经IPTG诱导表达,获得9个带有His标签的表达蛋白。以原核表达的外膜蛋白为诱饵蛋白,通过His-Pull-down试验及ELISA试验证实鸭疫里氏杆菌的Tuf蛋白能够与鸭补体因子H相互作用,且结合在鸭补体因子H的8-20SCRs结构域。本研究结果表明,鸭疫里氏杆菌RA-YM的Tuf蛋白能与鸭补体因子H结合,且结合在补体因子H的8-20SCRs。
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