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目的:建立大鼠颅脑损伤(traumatic brain injury, TBI)模型,观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)在损伤脑组织中存活、迁移和分化情况,以及对损伤神经功能恢复的影响;初步探讨hUC-MSCs治疗颅脑损伤的作用机制,为其在颅脑损伤治疗的应用提供理论依据。方法:取足月妊娠剖宫产健康新生儿的脐带,D-Hank’s液充分洗去残留血液,剔除脐动脉和脐静脉,将剩余的脐带间质组织剪成约1mm3大小的组织块,用0.2%胶原酶Ⅱ消化后放入含有20%胎牛血清(fetal bovineserum, FBS)、100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的DMEM/F12中培养。观察原代培养细胞的形态学变化,当细胞达到80%~90%汇合时,进行消化并传代培养。收集消化后的细胞,流式细胞术检测CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD73(SH3)-PE、CD11b-PE和CD34-FITC、CD19-FITC,HLA-DR (HLA-II)-FITC,并以小鼠IgG1-PE和小鼠IgG1-FITC作为同型对照。选健康成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,体重270g~320g,采用液压冲击法制备颅脑损伤模型,24h后,依照改良神经功能评分(modifiedNeurological Severity Score, mNSS)标准进行神经功能评分(Table1),将7~12分(中度损伤)的50只大鼠纳入试验并随机分为三组:(1) hUC-MSCs组:20只,评分结束后将1,1’-双十八烷-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, DiI)标记的第5代hUC-MSCs移植到颅脑损伤部位,取两点,每点5μl,总细胞数为1×10~6个;(2)磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)组:20只,颅脑损伤部位以PBS替代hCU-MSCs注射,亦取两点,每点5μl;(3)单纯颅脑损伤组:10只,仅行颅脑损伤,损伤部位既不移植hUC-MSCs,亦不注射PBS。另随机选10只大鼠为(4)假手术组:只开骨窗,不行颅脑损伤,亦不注射hUC-MSCs或PBS。大鼠于hUC-MSCs移植/PBS注射后第1、7、14、21、28d采用mNSS进行神经功能评分,观察大鼠神经功能改善和恢复情况。评分结束后处死大鼠,取脑组织行连续冰冻切片,厚5μm。免疫荧光方法检测hUC-MSCs在脑组织内存活、迁移、分化情况,以及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein, GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein2, MAP-2)、八因子相关抗原(factor VIII related antigen,Ⅷ-RAg)、神经微丝(neurofilament,NF)、巢蛋白(Nestin)的表达情况。结果:原代细胞培养24h后观察到有少量细胞贴壁,8~10d后细胞大部分贴壁。2w时,细胞汇合达到80%~90%,消化后按1:2或1:3的比例传代。细胞传代后生长迅速,形态均一,5~6d可传一代。流式细胞术检测结果显示:hUC-MSCs表达间充质干细胞表面抗原CD73、CD90、CD105,不表达造血前体细胞表面抗原CD34、B型淋巴细胞表面抗原CD19、中性粒细胞表面抗原CD11b、白细胞表面抗原CD45和HLA-DR,从而证实该细胞是MSCs。移植前采用噻唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazol-2-y1-2,5-diphenytetrazolium bromide, MTT]法检测hUC-MSCs细胞活力,细胞存活率达95%以上。移植hUC-MSCs移植后28d内,hUC-MSCs组死亡1只,死亡率4.8%;PBS组死亡10只,死亡率33.3%;单纯颅脑损伤组死亡6只,死亡率37.5%。hUC-MSCs组的死亡率低于PBS组和单纯颅脑损伤组,差异有统计学意义(P<0.05)。PBS组(5只)和单纯颅脑损伤组(3只)出现明显腹胀,hUC-MSCs组未发现明显腹胀的大鼠。hUC-MSCs组和PBS组比较,差异无统计学意义(P>0.05);hUC-MSCs组和单纯颅脑损伤组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。神经功能评分结果(Table3)显示:hUC-MSCs移植后,神经功能评分有随时间变化趋势,hUC-MSCs组神经功能恢复优于PBS组和单纯颅脑损伤组,差异有统计学意义(P<0.05)。hUC-MSCs移植28d后,脑组织切片行免疫组织荧光检测,发现hUC-MSCs在损伤灶存活,沿白质方向迁移且部分迁移至血管周围。部分移植细胞表达神经干细胞标志Nestin、神经元细胞标志NSE、NF、MAP2、星形胶质细胞表面标志GFAP和血管内皮细胞标志Ⅷ-R Ag。脑组织切片经4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染核发现,脑组织损伤部位细胞核碎裂、溶解,以PBS组和单纯颅脑损伤组数量为多,而hUC-MSCs移植组数量较少。结论:1. hUC-MSCs移植可明显促进大鼠颅脑损伤后神经功能恢复。2. hUC-MSCs可在大鼠颅脑损伤部位存活、迁移,并表达GFAP、NSE、MAP2、NF、Nestin、Ⅷ-R Ag。3. hUC-MSCs移植对颅脑损伤后消化系统功能的恢复可能发挥一定作用。