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纤维素是葡萄糖以β-1,4-糖苷键聚合而成的多糖,它是自然界中最为丰富的可再生生物资源,其产生的生物能源对人类的可持续发展具有重要的意义。纤维素酶分为三类:内切葡聚糖酶(EC3.1.2.4)、外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21),它们在自然界中分布极为广泛。高等植物、昆虫、软体动物、细菌、放线菌、真菌等都能产纤维素酶。此外,反刍动物的瘤胃和猪大肠中也存在产纤维素酶的细菌。随着能源日趋紧缺,人们对纤维素酶的研究也越来越广泛和深入。现在纤维素酶的应用已经扩展到许多行业,包括纺织、医药、食品加工、日用化工、废水处理以及饮料添加等各个领域。
许多已报道的产纤维素酶微生物通常来源于陆地,而我们的研究则致力于对海洋细菌资源的开发与利用。我们从厦门海洋三所提供的海洋细菌中筛选得到一株产纤维素酶的细菌Martelella mediterranea。通过构建基因组文库,首次克隆到了该菌的纤维素酶基因,并在大肠杆菌中得以表达,纯化蛋白以及研究该蛋白的酶学性质。主要研究结果如下:
1、从厦门海洋三所提供的海洋细菌中,编号为1A02928的M.mediterranea显示有纤维素酶活性。在纤维素平板上,用刚果红染色法检测出该菌株能产生水解圈,证明其具有纤维素酶活性。以1A02928总DNA为模板,PCR扩增得到16S rDNA送至华大基因(上海)测序。序列比对结果显示,1A02928与M.mediterranea strain2PR511-4同源性最高,为100％。
2、以pUC18为载体构建M.mediterranea基因组文库,通过纤维素平板刚果红染色法筛选重组克隆子,得到一个阳性克隆,命名为cel5D。序列分析表明该克隆子包含一个完整的ORF,全长为1,113 bp,G+C含量为62.98％,编码370个氨基酸。ORF仅由一个催化结构域(属于糖苷水解酶第5家族)组成。将cel5D翻译得到的蛋白命名为Cel5D。在蛋白质水平上,Cel5D与Rhizobium etli CIAT652氨基酸同源性最高为51％,说明cel5D是一个新基因。
3、设计引物,PCR扩增cel5D基因,并将其克隆到表达载体pGEX-6P-1上,在大肠杆菌DL21(DE3)中诱导表达,得到的重组蛋白pGEX-Cel5D经亲和层析柱纯化去掉GST标签。SDS-PAGE检测纯化后蛋白,Cel5D在36 KDa处产生一条清晰的条带。测定蛋白浓度为0.04314 mg/ml。
4、对纯化后的Cel5D进行酶学性质分析。该酶在60℃和pH5.0时酶活性最高；在pH3.0-11.0,60℃以下酶活性较为稳定。以纤维素为底物时,酶活力为1.6U/mg,Km=28.4mg/ml,Vmax=455μmol/(min·mg),Kcat=36.4./s。以大麦葡聚糖为底物时,Km=8.8 mg/ml,Vmax=87.7μmol/(min·mg),Kcat=3.5/s。除SDS对Cel5D活性有强烈的抑制作用外,金属离子以及化学试剂对酶活性影响不明显。薄层层析结果为该酶水解CMC-Na后的产物是纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖,证明Cel5D属于内切葡聚糖酶。
通过对该酶的酶学性质研究以及与糖苷水解酶第5家族中其它内切葡聚糖酶相比,发现Cel5D是一个pH耐受范围较广,不受重金属离子抑制,具有潜在应用价值的β-1,4-内切葡聚糖酶。