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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是目前困扰养猪业的一道世界性难题,研究表明PRRSV-GP5蛋白是PRRSV的主要保护性抗原,能引起有效的免疫应答,其编码基因ORF5是开发猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗的重要目的基因。同时,研究表明热休克蛋白70(HSP70)具有分子免疫佐剂作用。本试验将卡介苗(结核杆菌的减毒株)的HSP70基因与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5基因连接起来,进行融合表达,为后期进一步研究做准备。根据Genbank上已发表的结核杆菌HSP70基因(BX248335)设计并合成了一对特异性引物,从结核杆菌减毒菌株卡介苗中提取出总基因组作为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出目的基因片段HSP70,将其克隆到SimplepMD18-T载体上,经PCR、双酶切和序列测定证明所扩增片段是结核杆菌的HSP70基因,重组质粒命名为pMD18-HSP70。根据Genbank上已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SCQ株ORF5基因序列(DQ379479)设计并合成了一对特异性引物,从PRRSV的SCQ株中提取总RNA作为模板,通过RT-PCR扩增出目的片段ORF5基因,并将其克隆到Simple pMD18-T载体上,经PCR、双酶切和序列测定证明该片段是PRRSV的ORF5基因,重组质粒命名为pMD18-ORF5。将目的基因片段ORF5亚克隆到表达载体pET32a(+)的BamHⅠ与HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pET32a(+)-ORF5,经初步抗性筛选,并通过PCR、双酶切和序列测定证明该重组质粒构建成功。并将目的基因片段HSP70亚克隆到重组质粒pET-32a(+)-ORF5的HindⅢ和XholⅠ位点之间,构建重组质粒pET32a(+)-HSP70-ORF5。经初步抗性筛选,并通过PCR、双酶切和序列测定证明融合基因重组质粒pET32a(+)-ORF5-HSP70构建成功。将构建成功的重组质粒转化至新制备的大肠杆菌感受态细胞BL21,用PCR和双酶切方法筛选出阳性菌株。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)诱导融合蛋白表达,通过用不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同温度作诱导,确定了融合基因ORF5-HSP70的最适表达条件。对表达蛋白作SDS-PAGE和Western Blot分析,SDS-PAGE分析表明融合基因ORF5-HSP70以融合蛋白的形式得到了表达,分子量约为110 kDa,与预期结果一致,Western Blot分析表明表达蛋白能与重组蛋白高免血清发生特异性结合,证明表达蛋白是目的蛋白GP5-HSP70。最后,将蛋白进行纯化后,用分光光度比色法测出了融合蛋白的表达浓度为:0.57 mg/mL。本实验首次将猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因与卡介苗(结核杆菌)的HSP70基因结合起来构建融合基因原核表达质粒pET32a(+)-ORF5-HSP70,并在BL21中得到了表达。通过优化表达条件使融合蛋白得到了高效表达,并经纯化测出了融合蛋白的表达浓度。本实验为进一步探明HSP70对目的抗原猪繁殖与呼吸综合征ORF5蛋白的免疫增强作用奠定了基础,为下一步开发新一代基因工程蓝耳病疫苗做了准备。