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抗生素在被发现至今已被应用到生活的各个领域中,但抗生素的滥用也带来了一系列的问题,对于食品安全造成了严重的危害,因此对于新型的抗菌物质的寻找,以代替抗生素和解决抗生素残留问题是目前亟待解决的问题。由侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9菌株产生的抗菌肽BBL,具有抑菌谱广、耐酸碱性、耐高温性等优点,并且不易残留、抗药性产生几率小的优点,在食品防腐剂和饲料添加剂的方面具有广阔的应用前景。目前有关侧孢短芽孢杆菌抗菌肽的遗传信息、合成机制、免疫机制以及编码基因等方面相关的报道极少。侧孢短芽孢杆菌S62-9遗传信息定位在质粒上,已经完成了质粒的测序工作,得到了contigs。在contig4中发现了一个不完整的非核糖体肽合成酶NRPS-A基因。为了挖掘NRPS-A在抗菌肽BBL合成中的功能,本文通过TAIL-PCR技术获得NRPS-A的上游序列,通过基因簇序列分析和比对分析挖掘NRPS-A的功能以及其它功能基因,通过同源重组敲除的方式对NRPS-A基因进行敲除,验证该基因的功能。研究结果为探究NRPS-A基因在抗菌肽BBL合成中的功能提供基础,为编码基因的的解读与抗菌肽的合成途径的研究提供研究基础,也为利用基因工程的手段构建或改造抗菌肽BBL的高产菌株提供一个前提。现论文的主要研究结果如下:TAIL-PCR扩增非核糖体肽合成酶通过TAIL-PCR对侧孢短芽孢杆菌S62-9的质粒基因组中的非核糖体肽合成酶NRPS-A基因的上游序列进行扩增,得到了4条扩增条带。经过DNAMAN比对后得到1条2.74kb大小的序列。序列分析后得到了NRPS-A基因、pp-binding基因以及一个ABC基因;基因比对后,contig5和contig4拼接成了一个完整的基因决定簇。完整的A结构域基因,编码524个氨基酸;1个pp-binding基因编码83个氨基酸。生物信息学分析对拼接好的决定基因簇通过序列比对、同源性分析、底物特异性分析,基因簇分为合成、修饰、转运3个主要功能结构。同时将相关的基因进归类,分为合成结构BblG、转运结构BblF、以及其他的修饰结构。经过分析,合成相关结构由NRPS-A和pp-binding组成,属于一种非典型的非核糖体肽合成酶模块。NRPSA是非核糖体肽合成酶中的腺苷化结构域,其特异性底物为缬氨酸,构建了NRPS-A蛋白的三维构象,推测它在抗菌肽BBL合成中负责识别并活化特异性的氨基酸;ppbinding基因是聚酮合酶中的酰基载体蛋白,负责接受活化的酰化氨基酸;BblF功能域由1个ATP结合区域,2个跨膜区域组成的ABC转运蛋白系统,负责抗菌肽BBL的转运。NRPS-A敲除菌株的筛选与验证通过同源重组敲除的方法敲除NRPS-A基因的部分编码序列,随后的多步筛选得到了缺失突变体pAH-21和pAH-25。在PCR验证显示缺失突变体p AH-21和pAH-25已经完成敲除,敲除NRPS-A后菌株无抑菌圈的产生,说明NRPS-A基因与抗菌肽BBL的合成有直接关系。本文通过TAIL-PCR扩增得到一个非典型的非核糖体肽合成酶,分析了NRPS-A基因在抗菌肽BBL合成中的功能,基因敲除试验表明NRPS-A与抗菌肽BBL合成具有直接的关系,为抗菌肽BBL的合成途径与合成机理的研究提供基础。