草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国特有的淡水养殖鱼类,广泛分布于中国南北各流域的天然水体中。草鱼具有肉质鲜美、生长性能优越、适应性强等诸多优点,现已被移植到世界各地。据联合国粮农组织统计,2016年全球草鱼产量达到610万吨左右,俨然成为重要的经济养殖物种。然而,在草鱼养殖快速发展的背后,嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症严重威胁着草鱼养殖的持续发展。补体被认为是先天免疫系统的重要组成部分,在保护宿主免受外来病原体入侵方面起着重要作用。本论文采用嗜水气单胞菌作为介导因子,对草鱼三个补体相关基因(CFD、C4、C3)进行研究分析。取得了如下结果:1.草鱼补体CFD(gcCFD)基因的相关功能研究:通过RACE的方法得到gcCFD基因的全长cDNA为935 bp,包含753 bp的开放阅读框(ORF),编码250个氨基酸。通过比对分析发现,gcCFD是较为保守的补体蛋白,与其他硬骨鱼类具有较高的相似度。通过构建系统发育树发现,gcCFD的氨基酸序列与其他硬骨鱼类聚为一束,支持了传统进化理论。在健康状态下,gcCFD基因在草鱼的12个组织中均有不同程度的表达,在肝脏中表达水平最高。经嗜水气单胞菌感染后,gcCFD基因在6个免疫组织中的表达水平均出现显著性上调。用脂多糖、鞭毛蛋白、嗜水气单胞菌刺激肝细胞发现,三种因子均能诱导gcCFD基因的表达。通过嗜水气单胞菌刺激超表达gcCFD的肝细胞发现,同时能够显著上调补体C3基因以及免疫相关因子(如IL-1β、TNF-α和IFN)的表达,并显著提高NF-κB的活性。综上所述,gcCFD基因在草鱼免疫应答中起到至关重要的作用。2.草鱼补体C4(gcC4)基因的相关功能研究:通过RACE的方法得到gcC4基因的全长cDNA为5458 bp,包含5148 bp的开放阅读框(ORF),编码1715个氨基酸。通过比对分析发现,gcC4是较为保守的补体蛋白,与其他硬骨鱼类具有较高的相似度。通过构建系统发育树发现,gcC4的氨基酸序列与其他硬骨鱼类聚为一束,支持了传统进化理论。在健康状态下,gcC4基因在草鱼的12个组织中均有不同程度的表达,其中在肝脏的表达水平最高。在细菌感染期间,gcC4基因在6个免疫组织中的表达水平均发生不同程度的改变。通过Western blot和ELISA的方法检测肝脏及血清C4的蛋白水平发现,C4蛋白水平发生不同程度的改变。通过免疫组织化学的方法发现,在感染后,C4蛋白在肝脏的表达位置发生改变,C4在肝坏死区域及肝血窦中的表达明显增多。用脂多糖、鞭毛蛋白、嗜水气单胞菌刺激肝细胞发现,三种因子均能诱导gcC4基因的表达。通过嗜水气单胞菌刺激超表达gcC4的肝细胞发现,超表达gcC4的肝细胞能够显著抑制细菌的侵染及增殖,同时能够显著上调补体C3基因以及免疫相关因子(如IL-1β、TNF-α和IFN)的表达,并显著提高NF-κB的活性。综上所述,gcC4在草鱼免疫应答中起到至关重要的作用。3.草鱼补体C3(gcC3)基因的相关功能研究:在健康状态下,gcC3基因在草鱼的12个组织中以不同程度表达,在肝脏的表达水平最高。在细菌感染期间,gcC3基因在6个免疫组织中的表达水平均发生不同程度的改变。通过ELISA的方法检测肝脏及血清的C3蛋白水平同样发生不同程度的改变。通过组织切片发现,在感染过程中,肝脏发生不同程度的损伤及病变,经半定量系统评价得出肝脏在24 h时损伤最为严重。通过免疫组织化学的方法,C3蛋白在肝脏的表达位置发生迁移,在感染后的24 h时,C3在肝坏死区域及肝血窦中的表达明显增多。综上所述,gcC3在草鱼抵抗嗜水气单胞菌感染中起到重要的免疫作用,并且C3对损伤的肝组织能起到积极的修复作用。