目的:急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)发生后,无法获得快速且有效的脑血流重建是脑梗死灶进展的主要原因。近年来,由于脑梗死急性期血管内治疗材料的更新、技术的改进及普及,显著提高了急性期大血管闭塞性缺血性卒中患者脑血流的重建几率,部分抑制病灶进展的发生。但是,患者的临床预后转归与较高的血管再通率相比是不匹配的,部分原因可能是由于脑微循环内炎性微血栓的形成,致使脑微循环灌注水平无法有效改善。由于磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging,SWI)的发展,极大地提高了细小血管如脑髓质静脉和小静脉的可视性。然而,SWI最开始不能用于体内动脉血管的评估。主要原因是动脉和周围组织的磁敏感差异太小。因此,为使动脉像静脉一样可视,我们使用新型造影剂超小型超顺磁性氧化铁(ultra-small superparamagnetic iron oxide,USPIO)增强磁敏感加权成像(USPIO-SWI),诱导血管内磁敏感性的偏移。多项动物研究均提示,免疫调节剂如芬戈莫德(fingolimod)和抗CD49d单克隆抗体在不同的缺血性脑卒中动物模型上有显著疗效。基于这些颇具前景的研究结果,我们和其他团队均开展了免疫调节剂治疗缺血性脑卒中病人的可行性研究。然而,这些研究结果不一。因此,本研究的目的是在大鼠血栓栓塞性大脑中动脉闭塞模型上开展一种评估血管造影显示的再灌注水平的新型MRI体系,并且通过随机、盲法、安慰剂对照的前临床研究(pRCT)比较阿替普酶单独或联合芬戈莫德对脑血管造影灌注水平的差别。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是细胞因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)家族的成员之一,可以刺激或抑制细胞增殖、分化和存活。LIF可以促进神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的自我更新,对神经支持细胞的功能维持发挥重要作用。LIF是NSCs在缺血性脑梗死中发挥神经保护作用的主要因子。本部分研究对LIF转染NSCs(LIF-transfected NSCs,LIF-NSCs)是否可以减轻缺血性脑梗死大鼠的脑损伤,发挥促神经保护作用进行了探讨。方法:第一部分:为建立MRI评估脑血管造影灌注水平的方法体系,我们研究了15只成年大鼠。其中,9只正常大鼠用于确定USPIO强化SWI序列上动脉显影的最佳剂量。另外6只大鼠用于诱导血栓栓塞性脑梗死模型,以评估最优USPIO剂量在局灶性脑梗死病灶部位显影脑动脉的可行性。第二部分:通过前临床随机、盲法、安慰剂对照(preclinical randomized,blinded,placebo-controlled,pRCT)的实验研究,以明确芬戈莫德是否可以增强组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,tPA)治疗急性缺血性卒中的疗效。诱导血栓栓塞性大脑中动脉闭塞模型(embolic middle cerebral artery occlusion,eMCAO),术后2小时经磁共振血管成像显示血管闭塞且SWI无颅内出血的大鼠纳入研究。初级终点事件是24小时内脑梗死体积的增加以及24小时内脑出血转化的分型往有利的方向转变。探索终点事件是血管造影再灌注水平向有利的方向转变。样本量是每组30只大鼠。第三部分:我们将携带LIF基因的慢病毒转染NSCs以使其稳定过表达LIF。本研究分体外和体内两部分,体外研究LIF NSCs的增殖及分化能力。建立氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型以体外模拟缺血性脑梗死的病理生理条件,观察OGD条件下,LIF-NSCs分泌LIF的水平及抗凋亡能力。体内部分,我们建立大鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO),术后6小时,经尾静脉注射LIF-NSCs。在术后1天、3天和28天,分别通过磁共振的ADC(apparent diffusion coefficient,表观扩散系数)、T2以及DTI(diffusion tensor imaging,弥散张量成像)序列评估脑梗死体积及脑白质损伤情况。在术后7天、14天、21天和28天,经mNSS(modified neurological severity score,改良神经功能缺损评分)评估大鼠神经功能恢复情况。然后经免疫化学染色,观察大鼠脑内LIF的表达水平,以及胶质细胞增生情况。结果:当USPIO剂量为300μmol/kg时,USPIO-SWI序列可清楚成像大鼠脑内小动脉,而且此剂量下评估eMCAO大鼠脑动脉造影再灌注水平是可行的。本pRCT研究结果进一步证实了tPA联合芬戈莫德治疗eMCAO大鼠,可显著抑制脑梗死灶的进展(梗死灶进展的平均体积:34 mm~3 vs 18 mm~3,p=0.015),改善脑血管造影灌注水平(mTICI:69%vs 17%,p=0.001),且不增加颅内出血转化的风险。本研究结果提示LIF-NSCs在体外可稳定且持续表达LIF,且可促进NSCs的增殖。在OGD条件下,LIF-NSCs可以增加LIF的表达水平,减轻caspase 3的活化以抵抗细胞凋亡。通过尾静脉向MCAO大鼠体内注射LIF-NSCs可实现大鼠脑内过表达LIF,而且LIF-NSCs和其分化生成的星形胶质细胞均可持续分泌较高水平的LIF。此外,我们还发现LIF-NSCs治疗MCAO大鼠可以促进其神经功能的恢复,减小MRI图像上脑梗死体积。而且,病理分析结果表明,LIF-NSCs治疗可以促进大鼠白质损伤的修复,增加胶质细胞的再生。结论:本研究通过实施pRCT研究,揭示了USPIO-SWI评估缺血性脑卒中血管再通治疗后脑血管造影灌注水平的转化研究的可行性。而且,本研究提示靶向淋巴细胞的干预手段的疗效可能有赖于其血管保护效果以及改善脑血管造影灌注水平。LIF修饰的NSCs移植可以减轻OGD条件下细胞的凋亡,减小MCAO大鼠脑梗死体积,促进其神经功能的恢复,还可以减轻脑白质损伤。LIF-NSCs对缺血性脑梗死大鼠的脑保护效果,可能是由于NSCs作为载体增加缺血侧LIF的表达水平,提示LIF-NSCs有望成为今后治疗缺血性脑卒中的新型治疗手段。