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第一部分膜联蛋白Annexin1与脑出血的相关性研究目的:研究大鼠脑出血(ICH)后血清、脑组织中以及体外ICH模型中膜联蛋白Annexin1(ANXA1)在ICH后不同时间点的变化。方法:体内实验部分,随机任选42只大鼠分为假手术组和ICH后6h、12h、24h、48h、72h、1w共7组,每组6只。所有的大鼠在脑出血后相应的时间点被处死。在每组大鼠取血肿周围1.5-2mm范围内脑组织,利用双重免疫荧光和Western blot技术分析检测其ANXA1的表达,尾静脉采血提取血清,利用酶联免疫技术检测ANXA1水平。在体外实验中取人类脑血管内皮(h CMEC/D3)细胞依据体内实验部分分为7组,利用western blot检测内皮细胞中ANXA1的表达水平。结果:1、体内实验结果表明,大鼠脑出血后脑组织中ANXA1表达下降,以ICH后24h组ANXA1表达下降最显著(P<0.01);2、大鼠血清的ANXA1表达在ICH后呈先下降后恢复的趋势,在24h ANXA1分泌值达最低(P<0.05);3、体外血管内皮细胞实验结果ANXA1蛋白表达先下降后恢复,18h下降最明显(P<0.01);4、血清中ANXA1下降水平较脑组织及血管内皮细胞慢,恢复也相对迟缓。结论:1、ICH后血管内皮细胞ANXA1表达呈先下降后恢复,在脑组织及血清中ANXA1水平在脑出血24h后达最低;2、在体外实验中人类脑血管内皮(h CMEC/D3)细胞ANXA1表达与体内实验结果类似;3、血清中ANXA1的水平,在ICH后下降及恢复速度相对脑组织迟缓。第二部分人重组ANXA1在脑出血后血脑屏障损伤诱发早期脑损伤中的保护作用目的:探索大鼠尾静脉注射人重组ANXA1对大鼠脑出血预后及血脑屏障保护作用。方法:在体内实验中,任选120只,随机分为假手术组(sham)、脑出血+溶剂组(ICH+vehicle)、脑出血+人重组ANXA1低剂量组(ICH+ANXA1-L)、脑出血+人重组ANXA1中剂量组(ICH+ANXA1-M)、脑出血+人重组ANXA1高剂量组(ICH+ANXA1-H),共计5组(n=24/组)。在基底节注射胶原酶3小时后尾静脉注射rh ANXA1,脑出血后24小时,所有大鼠放血。每组取6只大鼠脑做切片进行TUNEL染色、Fluoro-Jade B(FJB)染色;每组取6只大鼠脑组织进行Western Blot分析和免疫共沉淀分析;另外每组取6只大鼠用于伊文思蓝染色检测血脑屏障的破坏,而剩下每组6只大鼠每进行脑水肿的评估。结果:1、TUNEL染色实验结果,脑出血组较假手术组凋亡指数明显增高。rh ANXA1中高剂量治疗组血管内皮细胞凋亡明显改善(P<0.01);2、FJB染色阳性细胞在脑出血组较假手术组明显增多,rh ANXA1中高剂量干预后FJB阳性细胞明显下降(P<0.01);3、高剂量组对诱导闭合蛋白和闭锁小带-1(ZO-1)蛋白水平上调有重要作用(P<0.01);4、rh ANXA1在脑出血后干预,血管中外渗到脑组织的伊文思蓝染料明显减少(P<0.01)。中高剂量的rh ANXA1能够改善ICH后白蛋白的外渗(P<0.05)。最后,脑水含量在高剂量组明显比低剂量组脑水含量低(P<0.01)。结论:通过提高脑出血后ANXA1的水平,能够改善脑出血预后和维护血脑屏障的完整性。第三部分膜联蛋白Annexin 1对大鼠脑出血后血脑屏障损伤保护作用机制的实验研究目的:通过小干扰RNA和定点突变技术研究ANXA1潜在的保护作用机制。方法:1、通过免疫共沉淀实验来分析ANXA1与β-肌动蛋白/FPR2受体之间作用在假手术组和ICH治疗组中的不同。2、使用免疫共沉淀方法,通过检测血管内皮细胞野生型和突变体的ANXA1磷酸化情况。3、筛选干扰效果最佳的si RNA进行干扰ANXA1的表达,检测干扰后或点突变后的内皮细胞渗透性。4、利用免疫荧光的方法检测F-肌动蛋白与ANXA1的分布关系,在氧合血红蛋白作用下的变化。5、通过免疫共沉淀的方法验证ANXA1与FPR2相互作用关系,以及对ANXA1的分泌影响。结果:1、ICH诱导ANXA1磷酸化,尤其在丝氨酸-27和苏氨酸-24;2、ANXA1对脑毛细血管内皮细胞的渗透性作用依赖磷酸化;3、ANXA1苏氨酸-24残基磷酸化破坏损害ANXA1形成β-肌动蛋白;4、ANXA1丝氨酸-27残基破坏将影响与FPR2蛋白相互作用,进而影响ANXA1分泌。结论:通过ANXA1的苏氨酸-24和丝氨酸-27的磷酸化可以防止脑出血后引发的血脑屏障功能障碍。在脑出血后ANXA1的磷酸化是脑血管内皮细胞的一种可能的自我修复策略。