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牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）能引起新生犊牛腹泻、呼吸道疾病和成年牛“冬痢”,是引起犊牛死亡的主要病原之一,其在牛群中长期循环,防控困难,这可能与BCoV存在持续感染的能力有关。部分冠状病毒利用细胞自噬来逃避机体的先天性免疫,造成病毒的持续感染。目前关于BCoV的致病机制尚不清楚。因此,本实验拟探究BCoV感染调控细胞自噬对病毒复制的影响及分子机制。（1）BCoV感染犊牛原代小肠上皮细胞（Bovine primary small intestinal epithelial cells,BIEC）体外模型的建立。采集新生犊牛的十二指肠样本,用双酶联合消化法分离小肠细胞,用相差贴壁法纯化小肠上皮细胞;用RT-PCR方法检测外源病毒和支原体;通过IFA检测细胞角蛋白18进行BIEC鉴定。然后用BCoV-002株感染BIEC 6h、12h、24h、48h、72h通过RT-PCR、IFA和Western blot检测BCoV感染情况。结果分离纯化得到鹅卵石样,能够表达上皮细胞角蛋白18,没有外源病原污染的BIEC。BCoV-002株能够感染BIEC,而且随着感染时间增加,病毒显著增殖。（2）探究BCoV调控BIEC自噬对病毒增殖的影响。用10 MOI的病毒感染BIEC和HRT-18细胞,通过Western blot检测不同感染时间点6h、12h、24h、48h、72h时自噬标志蛋白LC3B-II的表达情况,对照组为未感染病毒的细胞。然后用自噬调控药物雷帕霉素（Rapamycin,Rap）、氯喹（Chloroquine,CQ）和渥曼青霉素（Wortmannin,Wm）处理BIEC 12h,通过Western blot检测LC3B-II的表达情况,以筛选出合适浓度的自噬调控药物。Rap和CQ处理BIEC后用10 MOI病毒感染细胞24h,Wm处理BIEC后用10 MOI病毒感染细胞72h,通过Western blot检测BCoV-N的表达情况。结果发现病毒感染BIEC48h前LC3B-II的表达量均显著低于对照组,病毒抑制细胞自噬的现象在感染24h时最为显著,在感染72h后LC3B-II的表达量显著高于对照组,出现病毒促进细胞自噬的现象;而在病毒感染HRT-18细胞时发现不同感染时间点病毒均促进细胞自噬。筛选的Rap、CQ和Wm浓度分别是5μM、10μM和0.01μM,发现在病毒感染24h时,Rap促进自噬对BCoV-N的表达无明显影响,而CQ抑制自噬,促进BCoV-N的表达;在感染72h时,Wm抑制自噬,抑制BCoV-N的表达。（3）探究病毒调控BIEC自噬的分子机制。用10 MOI的病毒感染BIEC并做转录组学分析,通过数据的GO与KEGG分析。用10 MOI病毒感染BIEC,通过Western blot检测病毒感染24h和72h时m TOR依赖通路关键蛋白m TOR、AKT、AMPK和Erk1/2及其磷酸化蛋白的表达情况,检测非m TOR依赖通路蛋白Beclin1的表达情况。然后用si RNA-Beclin1转染BIEC沉默基因,通过Western blot检测Beclin1和LC3B-II的表达情况,用病毒感染si RNA-Beclin1转染的BIEC,通过Western blot检测感染24h和72h时BCoV-N的表达情况。用10 MOI病毒感染BIEC,通过Western blot检测感染24h和72h时自噬潮完整性标志蛋白P62的表达情况。结果提示病毒感染BIEC后上调了IP10/CXCL10、IRF7、IRF9、Mx A、OAS、IFI16等干扰素基因和IL-1A、IL-1B、IL-6、IL-8、IL-33、IL-18RAP、TNFSF10等促炎因子基因;下调了ITGA8、ITGA10、ITGB8等细胞膜成分基因。其中溶酶体生成前体基因FGE和自噬体生成抑制基因ITPR1被下调,说明病毒可能促进自噬体的生成,并抑制溶酶体的生成。之后发现在感染24h时病毒促进p-AKT和p-Erk1/2的表达,但对p-m TOR和p-AMPK的表达无显著影响;而且在感染72h时病毒对p-m TOR的表达无显著影响。在感染24h时病毒促进Beclin1的表达,但在72h时表达变化不显著,说明病毒可能通过非m TOR依赖途径的Beclin1通路来调控自噬。之后发现沉默Beclin1基因能显著抑制细胞自噬,沉默后,病毒感染24h时BCoV-N表达量无显著变化,在感染72h时BCoV-N表达量显著降低,说明通过沉默Beclin1抑制自噬可以抑制病毒复制。最后与对照组相比P62表达量在24h时显著降低,与24h相比在72h时显著升高,说明BCoV诱导不完全自噬。本研究成功建立了BCoV感染BIEC的体外模型;抑制BIEC自噬体降解可以促进病毒复制,抑制自噬体生成可以抑制病毒复制;感染过程中BCoV通过促进Beclin1来诱导BIEC的不完全自噬,沉默Beclin1可以抑制病毒复制。本实验为揭开BCoV造成持续感染的分子机制提供理论基础。