肝片吸虫病是由肝片吸虫（Fasciola hepatica）寄生于牛、羊等反刍动物的肝脏和胆管而引起的一种重要的人兽共患病。准确诊断是防控该病最重要的措施,因此建立一种灵敏、特异且在肝片吸虫感染整个时期都有效的诊断方法尤为重要。本试验采集人工感染绵羊肝脏中肝片吸虫成虫进行体外培养,收集制备排泄分泌产物（ESPs）。将其与人工感染肝片吸虫3 d、7 d、21 d、63 d、112 d的绵羊阳性血清,牛大片吸虫阳性血清及绵羊阴性血清通过免疫共沉淀（CoImmunoprecipitation,Co-IP）与液相色谱串联质谱分析（LC-MS/MS）技术筛选互作蛋白;通过蛋白表达分析筛选出肝片吸虫感染诊断标识蛋白,对其进行克隆、原核表达和纯化,通过蛋白质免疫印记（Western Blot,WB）试验分析蛋白的反应原性,以筛选的蛋白作为抗原进行间接ELISA试验,选取P/N值最高的蛋白作包被抗原建立ELISA方法并进行条件优化,然后进行交叉反应、灵敏性及重复性检验,最后对牛羊临床样品进行检测。本试验成功制备了肝片吸虫ESPs,在感染肝片吸虫3 d、7 d、21 d、63 d、112 d的阳性血清中分别筛选出257、265、266、264和264种蛋白,五个感染时期共有且不与大片吸虫血清反应的特异蛋白11种。通过蛋白分析对Cystinosin、ADP-ribosylation factor、Hepatocyte nuclear factor 3-alpha和一种未注释蛋白（A0A4E0RCU0）4种蛋白进行克隆表达,Cystinosin为包涵体表达,其余均为上清表达,WB结果表明4种蛋白与肝片吸虫血清均表现出较好的反应原性,ELISA试验表明ADP-ribosylation factor蛋白的P/N值最高,具有作为诊断抗原的潜力。以该蛋白为抗原建立的间接ELISA方法最优条件为:用磷酸缓冲溶液（PBS）将抗原稀释至1μg/m L于4℃包被过夜,选用酶标板稳定剂Ⅰ在37℃条件下封闭1 h,一抗用PBST以1:50的比例稀释后37℃孵育45 min,二抗用HRP藕联物稀释剂Ⅰ以1:20 000的倍数稀释,37℃孵育1.5 h,加入显色液TMB置37℃显色20 min。阴阳临界值为0.435,S/P值大于0.435的血清样品为阳性,反之则为阴性。本试验所建立方法无交叉反应,具有较好的灵敏性和重复性。通过该方法对采自于黑龙江、辽宁及内蒙古的483份绵羊血清及黑龙江的92份奶牛样品进行检测,绵羊的血清阳性率为8.70%,奶牛血清均为阴性。本试验通过Co-IP与LC-MS/MS技术成功筛选出11种诊断标识蛋白,分析发现ADP-ribosylation factor具有作为诊断抗原的潜力,以该蛋白建立的肝片吸虫病间接ELISA诊断方法无交叉反应,具有灵敏性高、重复性好等特点,适合于肝片吸虫感染各时期的检测。该研究为肝片吸虫病诊断试剂盒的研发奠定了基础。