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第一部分鼠尾草酚及其类似物缓解肿瘤恶病质的作用及机制研究背景:肿瘤恶病质是一种全身性进行性消耗综合征,且不能单纯通过营养支持手段逆转,临床表征主要为骨骼肌萎缩、脂肪损耗和食欲衰退导致的体重下降。目前人们对肿瘤恶病质的机制研究尚不全面,比较被认可的原因是由肿瘤分泌和机体释放的如TNF-α、IL-1、IL-6、PIF和ZAG等炎症因子共同引起,这些炎症因子可激活体内NF-κB信号通路,造成肌肉蛋白降解,加剧脂肪损耗,促进肿瘤恶病质的发生发展。但是由于肿瘤恶病质的发病机制复杂多样,临床上尚无有效的治疗药物被批准上市,因此针对肿瘤恶病质的新药开发刻不容缓。鼠尾草酚(CNS)源于多种唇形科植物如迷迭香和鼠尾草,是一种天然多酚类化合物,具有抗炎抗氧化的作用,且有NF-κB的抑制活性。但CNS及其类似物治疗肿瘤恶病质的效果及分子机制尚不清晰,有待进一步的研究。目的:通过C26细胞上清诱导建立C2C12肌萎缩模型和3T3-L1脂肪降解模型这两种体外肿瘤恶病质,应用C26移植瘤小鼠建立体内肿瘤恶病质动物模型,应用肿瘤药理学、细胞生物学、分子生物学、生物化学等技术,评价CNS及其类似物缓解肿瘤恶病质的作用及可能的分子机制。方法:(1)采用C26细胞上清诱导体外肿瘤恶病质C2C12肌萎缩和3T3-L1脂肪降解模型;(2)采用MTT法检测细胞活力;(3)采用细胞H&E染色统计C2C12肌管直径;(4)采用甘油检测试剂盒和甘油三酯检测试剂盒分别检测脂肪细胞和小鼠血清的甘油和甘油三酯含量;(5)采用油红O染色法评价脂滴大小;(6)通过接种C26细胞造模肿瘤恶病质小鼠模型,评价CNS及其类似物的缓解肿瘤恶病质作用;(7)采用组织H&E染色统计肌束和脂肪面积;(8)采用ELASA试剂盒检测小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量;(9)采用Western Blot技术检测细胞和组织蛋白水平。结果:(1)从14种天然植物提取物中最终筛选得到14号迷迭香提取物对体外C26细胞上清诱导的C2C12细胞肌萎缩模型有缓解作用,且肌萎缩逆转率有明显浓度依赖性。(2)14号迷迭香提取物的三种细分单组分迷迭香酸、鼠尾草酸和鼠尾草酚中,鼠尾草酚缓解C2C12肌管萎缩效果最强,且同样有浓度依赖性;(3)CNS及其类似物可有效缓解C26细胞上清诱导的C2C12肌管萎缩,随着浓度的增加,给药组C2C12肌管直径相比C26模型组显著增加,肌萎缩逆转率明显上升,存在浓度依赖性,其机制可能是CNS及其类似物一方面靶向NF-κB信号通路,抑制E3泛素连接酶Mu RF-1和Atrogin-1表达,抑制肌肉蛋白降解;另一方面促进AKT磷酸化激活,通过上调MHC和Myo D的表达,促进肌细胞蛋白合成;(4)CNS及其类似物可有效缓解C26细胞上清诱导的3T3-L1脂肪降解,随着浓度的增加,给药组3T3-L1脂肪降解程度显著降低,存在浓度依赖性。其机制可能是靶向抑制NF-κB、AMPK和HSL等信号通路;(5)CNS及其类似物DMCNS对C26肿瘤恶病质小鼠有一定的治疗作用。CNS治疗后,C26恶病质模型组小鼠体重和去瘤体重均明显回升,缓解脂肪组织消耗的作用较缓解肌肉组织消耗的效果更佳;同样,DMCNS治疗后,C26恶病质模型组小鼠体重和去瘤体重均明显回升,可明显缓解肌肉与脂肪组织消耗,对肌肉和脂肪组织的质量回复效果相当。分离小鼠肌肉与脂肪组织对CNS与DMCNS的作用机制进行了研究,结果与体外类似。结论:综上所述,CNS及其类似物可能通过靶向NF-κB信号通路缓解肿瘤恶病质,CNS作为广泛存在的天然多酚类化合物,用于缓解肿瘤恶病质的研究尚属首次,另外本文对于其类似物的延伸研究也首次证明了鼠尾草酚类的化合物也有缓解肿瘤恶病质的作用。CNS及其类似物可能是临床治疗肿瘤恶病质的潜力药物,针对其中的机制研究可为进一步的药物研发和临床治疗提供理论基础。第二部分NEK2激酶调节胃癌生物学功能及机制研究背景:NEK2是丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一,主要参与中心体组装与分离、染色质凝缩与分离以及纺锤体组装检查点信号调节等过程,与细胞有丝分裂和细胞周期调节密切相关,帮助维持基因组的稳定。越来越多的研究证明NEK2在多种肿瘤中高表达,诱导肿瘤的发生发展、促进肿瘤侵袭转移、引起肿瘤耐药并且与不良预后存在正相关。因此NEK2是十分有研究前景的重要潜在分子靶标。通过前期研究发现,胃癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤均对我们设计合成的NEK2小分子抑制剂体内外敏感,且这种敏感性不仅与NEK2的表达水平相关,还与KDM5B的表达水平相关。NEK2抑制剂能同时下调NEK2和KDM5B的蛋白水平,暗示NEK2与KDM5B可能存在尚未报道的直接或间接调控通路。目的:本课题旨在通过构建NEK2沉默与过表达的稳转株细胞,研究NEK2对胃癌发生发展的生物学作用,研究NEK2对KDM5B的调控作用及具体分子机制,发现影响胃癌发生发展的新分子信号通路,为临床靶向抗癌治疗研究提供新的方向和思路。方法:(1)采用tet-on和tet-off系统分别构建NEK2沉默和过表达胃癌单克隆稳转株;(2)采用CCK-8法和克隆形成实验检测肿瘤细胞增殖能力;(3)采用细胞划痕和Transwell实验检测肿瘤细胞迁移能力;(4)采用基于PI染色法的流式细胞术检测细胞周期;(5)采用Western Blot检测肿瘤细胞蛋白表达情况;(6)采用Co-IP实验检测NEK2与KDM5B之间的蛋白相互作用;(7)采用裸小鼠异种移植瘤模型实验观察NEK2沉默和过表达下的肿瘤生长。结果:(1)NEK2与KDM5B在多数胃癌细胞中高表达;(2)MGC-803中沉默NEK2抑制细胞增殖和迁移,并导致周期阻滞,抑制肿瘤生长;(3)MGC-803中沉默NEK2导致NEK2蛋白水平下调,同时下调了KDM5B的蛋白表达,增加了H3K4me3的表达;(4)BGC-823中过表达NEK2促进细胞增殖和迁移,促进肿瘤生长但并不影响细胞周期;(5)BGC-823中过表达NEK2导致NEK2蛋白水平上调,同时上调了KDM5B的蛋白表达,降低了H3K4me3的表达;(6)进一步的Co-IP结果表明NEK2并不直接调控KDM5B,而是通过激活β-catenin/Wnt信号通路调控KDM5B/H3K4me3,即NEK2通过激活β-catenin促进c-Myc表达,进一步促进KDM5B表达增加,H3K4me3表达降低。(7)通过c-Myc和KDM5B抑制剂验证了上述信号通路的上下游关系。(8)在裸小鼠异种移植瘤模型的肿瘤组织上进一步验证了NEK2通过β-catenin/c-Myc调控KDM5B/H3K4me3的分子机制。结论:本文揭示了NEK2在胃癌发生发展中发挥的作用,沉默NEK2抑制胃癌的增殖、迁移以及正常周期进程,过表达NEK2促进胃癌的增殖和迁移,并且首次揭示NEK2对KDM5B的调控作用,是通过激活β-catenin/Wnt信号通路调节KDM5B/H3K4me3的蛋白表达。该分子通路研究属于本实验室首次报道,具有创新性,对于临床抗肿瘤分子靶向药物的研究有着积极的作用。