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本研究参照GenBank收录的绵羊凝乳酶原前体cDNA序列(GenBank No:X53037)设计RT-PCR、PCR与巢式引物,以新生5天的西农萨能羊公羔羊为研究对象,利用手术法采集羔羊皱胃组织,利用Trizol法提取皱胃组织总RNA,经过电泳鉴定后,以总RNA为模板利用RT-PCR方法获得西农萨能羊凝乳酶原前体cDNA序列,以cDNA序列为模板进行扩增和T载体连接测序。利用软件NCBI BLASTn、BLASTp与ClustalW对该基因的测序结果进行序列比对、进化树分析;利用软件Compute pI/MW、MLRC、SignalP V3.0分别分析该基因的物理性质、二级结构与折叠类型、信号肽剪切位点;利用软件FeatureMap3D、SWISS-MODE分析该基因的三级结构与活性中心位点。根据测序结果设计引物,利用酵母整合质粒载体pPICZαA构建重组质粒,电击转化法将重组质粒整合至巴斯德毕赤酵母基因组DNA,筛选鉴定凝乳酶原重组转化子。获得以下研究结果:1.克隆了西农萨能羊凝乳酶原前体基因cDNA序列,全长1292bp,编码381个氨基酸,该基因cDNA序列登录GenBank(GenBank No:EF199763)。序列分析表明,西农萨能羊凝乳酶原前体基因与山羊、牛、绵羊、狷羚、骆驼、狗、人、猪、恒河猴、兔子凝乳酶原的核苷酸同源性分别为99.41%、98.74%、95.29%、95.81%、87.48%、83.69%、81.91%、67.43%、66.74%、66.39%,氨基酸同源性分别为99.21%、98.42%、93.70%、93.42%、83.99%、74.09%、57.22%、56.37%、57.18%、54.18%。2.物理性质分析表明,西农萨能羊凝乳酶原的分子量为大约为42.1kDa,成熟凝乳酶的分子量为35.5kDa,等电点为4.45。3.通过对凝乳酶原前体基因二级结构与折叠类型的分析表明,α螺旋短片段约占总氨基酸的8.36%,β折叠约占总氨基酸的32.82%,α螺旋短片在1-175氨基酸残基组成的N端区域和176-323氨基酸残基组成的C端区域无相同的片段。4.凝乳酶原前体蛋白存在一个16个氨基酸的信号肽序列,信号肽剪切位点分析表明,西农萨能羊凝乳酶原基因的信号肽剪切位点位于Met16-Gly17之间。5.三级结构分析表明:本研究克隆出的凝乳酶原前体基因形成的成熟凝乳酶在244位点为甘氨酸,为B型凝乳酶。两个天冬氨基酸活性位点:Asp32和Asp215,维持活性中心三维构象的氨基酸Thr33、Ser35、Thr216、Thr218、NHGly217和NHGly34,二硫键:Cys45-Cys50,Cys206-Cys210和Cys250-Cys283均无变异,能够形成正确的二裂片三维构象。6.利用设计的引物和酵母分泌型表达载体pPICZαA成功构建了西农萨能羊凝乳酶原前体基因的非融合蛋白和融合蛋白重组表达载体pPICZ-T1、pPICZ-T2,电击转化巴斯德毕赤酵母后,成功将重组西农萨能羊凝乳酶原前体表达质粒pPICZ-T1、pPICZ-T2整合至巴斯德毕赤酵母的基因组DNA,筛选出能够用于表达西农萨能羊凝乳酶原前体基因的非融合蛋白和融合蛋白重组转化子,为凝乳酶表达研究和工厂化生产提供了试验数据。