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目的：
自噬是一种在进化上高度保守的、复杂的细胞降解、回收机制，在眼部细胞生长发育和一些生理病理过程中都有着重要作用。小梁网是眼内房水流出通道的主要调节器，然而小梁网组织会随着年龄增加而发生细胞老化。小梁网组织功能障碍将导致眼内压病理性升高，进一步诱发青光眼等严重的眼部疾病。为了研究自噬在小梁网组织中的活化情况，本研究收集了40例健康捐献者的小梁网组织标本，检测自噬相关指标LC3B及P62的表达情况，并分析其与年龄及性别的相关性，这有助于加深对小梁网组织退行性疾病的认识，也为日后青光眼活体标本研究提供一定的实验和理论基础。
核转录因子κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一类进化保守的转录因子的总称，在青光眼发生发展中发挥重要作用。其中P65是激活最多、效应最广的NF-κB亚型。此外，最新的研究发现NF-κB与自噬之间存在相互调控机制。本研究通过慢病毒载体介导的干扰技术，分别建立了P62、P65基因沉默的人小梁网细胞体系(Human trabecular meshwork，HTM)，并通过H2O2诱导HTM细胞发生氧化应激反应，探讨P62和P65对HTM细胞活性的影响。此外，慢病毒干扰体系具有高效性和稳定性，可在后续实验中应用于探究自噬及NF-κB信号通路上其他关键蛋白的生物学作用;同时亦有助于探索自噬、NF-κB与青光眼三者的相关性及具体内在作用机制，为临床预防和治疗青光眼提供新的思路。
方法：
1.本研究收集了浙江大学附属第一医院2014年1月至2018年6月共40例健康角膜捐献者病例：根据年龄分为≥50岁组和≤40岁组;根据性别分为男性组和女性组。用免疫组织化学（免疫酶标）方法检测小梁组织中LC3B及P62的蛋白表达及分布情况;通过Image-Pro Plus6.0软件半定量分析、判断自噬活化情况;采用Students t test分析自噬与年龄、性别的相关性。
2.在慢病毒干扰载体中插入P62、P65基因shRNA片段构建干扰载体质粒;利用293T细胞及慢病毒包装质粒体系进行病毒包装、浓缩。
3.使用慢病毒感染HTM细胞，利用荧光显微镜、流式细胞术测定感染效率，通过Q-PCR及Western-Blot检测干扰效果，从而建立P62、P65蛋白沉默的HTM细胞体系(P62-shRNA-HTM、P65-shRNA-HTM)。
4.利用H2O2刺激野生型HTM(WT-HTM)、空载病毒感染的HTM(NC-HTM)、P62-shRNA-HTM、P65-shRNA-HTM建立氧化应激损伤模型，通过CCK8检测细胞活性。
结果：
1.正常TM组织中年龄≥50岁组P62平均光密度值明显低于≤40岁组，差异具有统计学意义(p＜0.01);LC3B相比P62蛋白表达较弱，年龄≥50岁组表达量高于≤40岁组且差异具有统计学意义(p＜0.05)。而不同性别之间比较P62、LC3B蛋白表达则无统计学差异。
2.成功构建P62、P65慢病毒干扰载体质粒：P62-shRNA1、P62-shRNA2、P62-shRNA3、P62-shRNA4、P65-shRNA1、P65-shRNA2、P65-shRNA3、P65-shRNA4;利用慢病毒包装质粒体系及293T细胞包装、浓缩得到高浓度病毒。
3.病毒感染HTM细胞后，流式细胞仪检测慢病毒感染效率可达90％以上;P62-shRNA1、P65-shRNA1沉默效果最佳，干扰效率达到75％以上;而空载质粒对照组蛋白表达无明显影响。
4.200μM浓度H2O2可诱导WT-HTM细胞发生氧化应激损伤(p＜0.05);在200μM浓度H2O2刺激下，P62-shRNA-HTM组细胞死亡率与WT-HTM组相比升高44.6％(p＜0.001)，P65-shRNA-HTM组则增高65.5％(p＜0.0001);而NC-HTM细胞活性与WT-HTM相比无统计学差异(p＞0.05)。
结论：
1.正常TM组织中自噬活化程度与年龄呈正相关，与性别无相关性。
2.成功利用慢病毒载体介导的干扰技术，分别建立P62、P65蛋白沉默的HTM细胞体系。
3.在氧化应激状态下分别沉默P62及P65蛋白均可导致HTM细胞活性降低。
自噬是一种在进化上高度保守的、复杂的细胞降解、回收机制，在眼部细胞生长发育和一些生理病理过程中都有着重要作用。小梁网是眼内房水流出通道的主要调节器，然而小梁网组织会随着年龄增加而发生细胞老化。小梁网组织功能障碍将导致眼内压病理性升高，进一步诱发青光眼等严重的眼部疾病。为了研究自噬在小梁网组织中的活化情况，本研究收集了40例健康捐献者的小梁网组织标本，检测自噬相关指标LC3B及P62的表达情况，并分析其与年龄及性别的相关性，这有助于加深对小梁网组织退行性疾病的认识，也为日后青光眼活体标本研究提供一定的实验和理论基础。
核转录因子κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一类进化保守的转录因子的总称，在青光眼发生发展中发挥重要作用。其中P65是激活最多、效应最广的NF-κB亚型。此外，最新的研究发现NF-κB与自噬之间存在相互调控机制。本研究通过慢病毒载体介导的干扰技术，分别建立了P62、P65基因沉默的人小梁网细胞体系(Human trabecular meshwork，HTM)，并通过H2O2诱导HTM细胞发生氧化应激反应，探讨P62和P65对HTM细胞活性的影响。此外，慢病毒干扰体系具有高效性和稳定性，可在后续实验中应用于探究自噬及NF-κB信号通路上其他关键蛋白的生物学作用;同时亦有助于探索自噬、NF-κB与青光眼三者的相关性及具体内在作用机制，为临床预防和治疗青光眼提供新的思路。
方法：
1.本研究收集了浙江大学附属第一医院2014年1月至2018年6月共40例健康角膜捐献者病例：根据年龄分为≥50岁组和≤40岁组;根据性别分为男性组和女性组。用免疫组织化学（免疫酶标）方法检测小梁组织中LC3B及P62的蛋白表达及分布情况;通过Image-Pro Plus6.0软件半定量分析、判断自噬活化情况;采用Students t test分析自噬与年龄、性别的相关性。
2.在慢病毒干扰载体中插入P62、P65基因shRNA片段构建干扰载体质粒;利用293T细胞及慢病毒包装质粒体系进行病毒包装、浓缩。
3.使用慢病毒感染HTM细胞，利用荧光显微镜、流式细胞术测定感染效率，通过Q-PCR及Western-Blot检测干扰效果，从而建立P62、P65蛋白沉默的HTM细胞体系(P62-shRNA-HTM、P65-shRNA-HTM)。
4.利用H2O2刺激野生型HTM(WT-HTM)、空载病毒感染的HTM(NC-HTM)、P62-shRNA-HTM、P65-shRNA-HTM建立氧化应激损伤模型，通过CCK8检测细胞活性。
结果：
1.正常TM组织中年龄≥50岁组P62平均光密度值明显低于≤40岁组，差异具有统计学意义(p＜0.01);LC3B相比P62蛋白表达较弱，年龄≥50岁组表达量高于≤40岁组且差异具有统计学意义(p＜0.05)。而不同性别之间比较P62、LC3B蛋白表达则无统计学差异。
2.成功构建P62、P65慢病毒干扰载体质粒：P62-shRNA1、P62-shRNA2、P62-shRNA3、P62-shRNA4、P65-shRNA1、P65-shRNA2、P65-shRNA3、P65-shRNA4;利用慢病毒包装质粒体系及293T细胞包装、浓缩得到高浓度病毒。
3.病毒感染HTM细胞后，流式细胞仪检测慢病毒感染效率可达90％以上;P62-shRNA1、P65-shRNA1沉默效果最佳，干扰效率达到75％以上;而空载质粒对照组蛋白表达无明显影响。
4.200μM浓度H2O2可诱导WT-HTM细胞发生氧化应激损伤(p＜0.05);在200μM浓度H2O2刺激下，P62-shRNA-HTM组细胞死亡率与WT-HTM组相比升高44.6％(p＜0.001)，P65-shRNA-HTM组则增高65.5％(p＜0.0001);而NC-HTM细胞活性与WT-HTM相比无统计学差异(p＞0.05)。
结论：
1.正常TM组织中自噬活化程度与年龄呈正相关，与性别无相关性。
2.成功利用慢病毒载体介导的干扰技术，分别建立P62、P65蛋白沉默的HTM细胞体系。
3.在氧化应激状态下分别沉默P62及P65蛋白均可导致HTM细胞活性降低。