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研究背景和目的创伤性脑损伤是一类致死及致残率极高的临床常见疾病,其愈后恢复不佳与神经元轴突再生障碍密切相关。炎症反应可显著改变损伤后修复微环境,抑制因素的增多和促进因素的缺乏导致轴突再生受限。轴突导向分子ephrin A3主要表达于星形胶质细胞(astrocyte,AS)表面,为神经元膜蛋白Eph A4的主要激活配体。炎症状态下反应性增殖的AS是否可通过ephrin A3的改变影响神经元突起生长目前还不太清楚。近年来研究发现细胞周期末期促进复合物(APC)及其调节亚基Cdh1可参与神经元轴突生长调控。下调Cdh1与下调Eph A4效应一致,均可促进突起生长。但二者之间是否具有相互影响有待进一步研究。本研究拟采用LPS刺激AS模拟炎症反应,观察炎症状态下AS表面ephrin A3的表达变化及其对神经元突起生长的影响,通过si RNA技术下调Eph A4,重组慢病毒下调神经元Cdh1基因表达,探讨APC-Cdh1在ephrin A3/Eph A4影响神经元突起生长过程中的作用。研究方法与结果方法:实验一(炎症状态下AS表面ephrin A3的变化及对神经元突起生长的影响):体外培养皮质AS,随机化分为C组及LPS处理组(1,5,10,20,40μg/ml),通过细胞计数及Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)确定最佳刺激浓度;最佳刺激浓度刺激AS,不同时间点检测ephrin A3的表达变化(12 h,24 h,48 h,72 h);体外培养皮质神经元(DIV 6 d)分别种植于C组及LPS组AS表面,或采用C组及LPS组AS培养基继续培养神经元24 h,采用免疫荧光计量神经元最长突起长度;si RNA沉默神经元Eph A4后再种植于C组及LPS组AS表面,分组为control-C组、control-LPS组、si RNA-C组、si RNA-LPS组,免疫荧光检测神经元最长突起长度。实验二(APC-Cdh1对ephrin A3/Eph A4信号途径突起生长抑制作用的影响):采用人工合成ephrin A3-Fc-Ig G分子及Fc-Ig G分子分别代替LPS组及control组AS,分组为A3-Fc组及Fc组,免疫荧光计量神经元最长突起长度;免疫共沉淀(IP)检测神经元Eph A4的激活及Eph A4与APC及Cdh1之间的相互作用。重组慢病毒Lv-cdh1-si RNA下调神经元Cdh1基因表达后,种植于Fc-Ig G或ephrin A3-Fc-Ig G包被后的细胞培养板,分组为Lv-control-Fc组、Lv-control-A3-Fc组、Lv-cdh1-Fc组、Lv-cdh1-A3-Fc组。免疫荧光检测神经元最长突起长度;将下调Cdh1后的神经元种植在control组及LPS组AS表面,分组为Lv-control-C组、Lv-control-LPS组、Lv-cdh1-C组、Lv-cdh1-LPS组。免疫荧光检测神经元最长突起长度。结果:细胞计数及Western blot结果显示20μg/ml LPS浓度可最有效刺激AS增殖,且随时间延长,LPS组ephrin A3表达逐渐增高,持续至少72 h,与C组相比,差异具有显著性(P<0.05)。免疫荧光结果显示种植于LPS组AS表面的突起生长显著受抑制,相比于种植于C组AS表面者突起长度明显较短,具有统计学差异(P<0.001);但C组与LPS组培养基作用后神经元突起长度无显著性差异(P>0.05)。si RNA沉默Eph A4后,si RNA-C组与si RNA-LPS组相比,突起长度无显著性差异(P>0.05)。A3-Fc组神经元突起相比Fc组较短,差异具有统计学意义(P<0.001);IP结果显示A3-Fc组神经元Eph A4磷酸化激活增多,且Eph A4与APC2及Cdh1间存在相互作用。重组慢病毒下调神经元Cdh1后,Lv-control-A3-Fc组与Lv-control-Fc组相比突起长度显著降低,有统计学差异(P<0.001),Lv-cdh1-A3-Fc组与Lv-control-A3-Fc组相比突起长度延长,差异具有显著性(P<0.001);Lv-control-LPS组与Lv-control-C组相比突起长度降低,有统计学差异(P<0.001),Lv-cdh1-LPS组与Lv-control-LPS相比突起长度增加,差异具有显著性(P<0.001)。结论:LPS刺激后星形胶质细胞可通过ephrin A3/Eph A4信号途径抑制神经元突起生长,下调神经元cdh1可有效缓解这一抑制作用。