【摘 要】
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猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的肠道传染病。虽然各个年龄段的猪都能感染该病,并表现出不同的症状,但该病毒对小猪来说是最致命的,7日龄以内发病小猪的死亡率可以达到100%。PEDV于20世纪80年代首次传播到中国,自那时起,
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猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的肠道传染病。虽然各个年龄段的猪都能感染该病,并表现出不同的症状,但该病毒对小猪来说是最致命的,7日龄以内发病小猪的死亡率可以达到100%。PEDV于20世纪80年代首次传播到中国,自那时起,它已成为引起腹泻的最常见病毒之一。我国2010年10月出现了PEDV变异株,引起了PED大规模暴发,给经济带来了巨大的损失。因此,开发用于检测PEDV的试剂和建立快速检测方法显得尤为重要。PEDV的S蛋白可被划分为S1和S2两个功能区,其中S1区包含了病毒主要的中和表位和受体结合域。鉴于此,本研究选取PEDV S1区进行高效表达,并对表达的蛋白进行纯化和制备单克隆抗体。以PEDV全基因组为模板,扩增PEDV S基因的亲水区,将其克隆至p MAl-c2E原核表达载体,获得重组质粒p MAl-c2E-PEDV-S。经Eco RI/Sal I双酶切鉴定正确后,转化BL21菌,经IPTG诱导,成功表达了约74 KDa的重组蛋白MBP-PEDV-S,亲和层析法纯化重组蛋白。用重组蛋白免疫3只健康的6-8周龄雌性BALB/c小鼠,将小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得了4株杂交瘤细胞株1B10、1B11、1C8、3L3,均能稳定分泌抗PEDV S蛋白抗体,其腹水效价都高于1:100,000。获得的4株单抗经IFA和Western blotting检测,结果显示均与PEDV具有良好的反应性。而且3株单抗重链为Ig G2a,1株重链为Ig G2b;3株轻链为Kappa,1株轻链为Lambda。本研究采用原核表达制备了PEDV S蛋白单克隆抗体,为S蛋白结构和功能的研究,以及血清学快速检测方法奠定基础。PEDV的N蛋白具有多种功能,但与其相互作用蛋白的相关文献较少。因此,筛选和鉴定与PEDV N蛋白互作的蛋白,对了解PEDV的致病机制具有重要的意义。PEDV N蛋白在感染宿主细胞的过程中发挥重要作用,而病毒感染宿主细胞,需要病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用。本研究以PEDV LZW毒株全基因组为模板,扩增PEDV N基因,将N基因克隆至p CMV-FLAG-N真核表达载体,获得重组质粒p CMV-FLAG-N-PEDV-N。将测序正确的重组质粒转染HEK293T细胞,利用IP实验特异性沉淀p CMV-FLAG-N-PEDVN蛋白及其相互作用的宿主蛋白,并进行质谱分析。本研究将免疫共沉淀（Co-IP）与液相质谱（LC-MS）技术相结合,鉴定到426个与PEDV N蛋白潜在互作的宿主蛋白,利用生物信息学软件对差异表达蛋白的生物学功能进行分析,并通过String数据库绘制了蛋白互作的网络图。GO注释和KEGG富集分析结果表明,与PEDV N蛋白互作宿主蛋白主要参与了细胞氮化合物代谢过程、基因表达、核糖核蛋白复合物生物发生与组装、核糖体生物发生、RNA降解、核质转运、m RNA监视、紧密连接、甲型流感和与癌症有关通路,也参与了c AMP信号通路和MAPK信号通路。根据质谱结果,挑选肽段数大于或等于2的蛋白,得到与PEDV N蛋白互作可能性大的宿主蛋白。通过Co-IP验证了PEDV N蛋白与NCL、YTHDC1、DDX24、TRIM21、G3BP1、Vimentin、HSPA8蛋白相互作用,验证了质谱结果的可靠性,也为研究PEDV的致病机制奠定了基础。本研究成功表达和纯化了PEDV S蛋白并制备了单克隆抗体,有利于深入研究S蛋白的结构和功能,并鉴定了与PEDV N蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示PEDV的致病机制奠定了基础。
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