石杉碱甲是一种植物源性生物碱,可以用来治疗阿尔茨海默症。现阶段,工业生产石杉碱甲主要包括从石杉科植物中提取和化学合成。然而,存在植物生长缓慢,化学合成收率低等问题,生物生产石杉碱甲正逐渐成为替代植物提取和化学合成的策略。遗憾的是,目前对其生物合成途径和机制知之甚少。因此,本课题旨在探究石杉碱甲的生物合成途径并实现其在微生物中的合成。首先,石杉碱甲生物合成中三个关键酶赖氨酸脱羧酶,铜胺氧化酶和III型聚酮合酶在大肠杆菌中成功表达,以L-赖氨酸为底物进行摇瓶发酵,成功检测到了石杉碱甲生物合成中的关键前体Δ1-哌啶烯。接下来,实验针对搭建石杉碱甲生物合成真核表达体系展开。首先验证了酿酒酵母菌株INVSc1与p YES2质粒的适配性,接下来探究了毕赤酵母和酿酒酵母表达关键酶基因的可行性,并对相关酶进行了简单的功能验证。此外,鉴于内生真菌可生产药物活性类似物,本实验尝试从蛇足石杉叶片中进行分离筛选,获得了14株内生真菌。菌种鉴定的结果表明,分离出的内生真菌多为刺盘孢属。这项工作为后续筛选产石杉碱甲的内生真菌提供了基础。最后,我们用上述分离出的内生真菌进行了发酵实验,对发酵产物进行检测,证明上述分离出的内生真菌中有一株可以产石杉碱甲。该菌株的发现为后期探索石杉碱甲生物合成途径的关键酶提供了重要线索,有助于帮助实现石杉碱甲的完全生物合成。