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肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是由汉坦病毒（Hantavirus）感染所致的自然疫源性疾病,病死率约为2～10%。吉林省是我国汉坦病毒感染的高发区。HFRS临床表现缺乏特异性,漏诊及误诊率较高,临床特征及流行病学研究不足。目前一致认为HFRS的发病机制与血管内皮损伤、血小板功能障碍及过度的免疫应答有关。汉坦病毒主要的靶细胞是内皮细胞,天然免疫系统通过模式识别受体（PRRs）识别外来病原微生物的病原相关分子模式（PAMPs）,诱导I型干扰素（IFN-Ⅰ）及炎症因子的产生,但具体分子机制还不清楚。本研究通过吉林省HFRS临床病例的回顾性分析,确定HFRS的流行病学特点及临床特征,研究HTNV结构蛋白抑制宿主干扰素抗病毒反应机制,为HFRS临床诊断及HTNV发病机制研究提供了理论依据。1.吉林省HFRS流行病学特点及临床特征:通过单中心回顾性研究,收集2012-2019年吉林大学第一医院2113例HFRS患者临床资料,包括发病-入院时间间隔、在院时间、临床表现（发热、头痛、腰痛、眼眶痛、皮肤潮红及出血点等）、五期经过（发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期及恢复期）、并发症、实验室检查及肾脏超声、出血热抗体、预后等相关数据,采用SAS9.3软件进行统计分析HFRS 7年的流行特点及重症率变化,发现吉林省HFRS流行特征是青壮年、男性高发,高龄是重症发生的危险因素;流行季节呈明显双峰趋势,4～6月为主峰,10～12月为次峰,其中10～12月HFRS重症率更高;近年来HFRS流行地区有从山区向平原扩散,农村向城市转移的趋势;仍以山区重症率最高,流行趋势呈混合型。通过多变量Logistic回归分析临床症状及辅助检查等相关数据,发现HFRS典型的“三红三痛”合并消化道症状更突出,多期重叠是预测重症发生重要指标,神经系统受损及腔道出血是预判HFRS重症的重要因素。白细胞、血小板、尿素氮、肌酐在病毒感染后的第4～7天,乳酸脱氢酶和α-羟丁酸酶在4～5天的每个时间点上重症组均较轻症组差异极显著,表明白细胞、血小板、尿素氮、肌酐、乳酸脱氢酶和α-羟丁酸酶可以作为早期预测疾病严重程度的参考指标。腹部超声示重症患者更容易出现胰腺炎、腹腔积液及胆囊壁水肿,提示其可作为重症的预测指标。病死率除2014年略有升高外,整体呈下降趋势,低于1%,可能与临床医生对HFRS的认识度提高及早期干预有关。2.HFRS临床炎症标志物鉴定:将2013-2019年373例HFRS患者临床炎症标志物（铁蛋白、PCT和CRP）单独进行统计,分析其与疾病严重程度、细菌感染及预后的关系;在评估炎症标志物在HFRS的价值中利用ROC曲线分析疾病严重程度,合并细菌感染或预后变量,并使用SPSS 19.0软件计算ROC曲线（AUC）和95%置信区间（CI）下的面积进行量化。结果发现PCT和血清铁蛋白预测HFRS严重程度的AUC值分别为0.824（95%CI 0.773～0.875,p＜0.001）和0.732（95%CI 0.678～0.786,p＜0.001）,而CRP预测HFRS严重程度的AUC值为0.614（95%CI 0.552～0.676,p=0.001）,表明PCT和铁蛋白在预测HFRS严重程度方面更有意义。用于预测细菌感染的PCT和CRP的AUC值分别为0.527（95%CI 0.464～0.589,p=0.401）和0.588（95%CI 0.525～0.652,p=0.005）。结果表明CRP较PCT为更理想的预测HFRS患者合并细菌感染的潜在炎症标志物。血清铁蛋白、PCT和CRP预测病死率的AUC值分别为0.853（95%CI 0.774～0.933,p＜0.001）、0.737（95%CI 0.587～0.887,p=0.002）和0.703（95%CI 0.577～0.828,p=0.008）,表明血清铁蛋白是预测HFRS死亡率的最佳炎症标志物。因此,血清铁蛋白和PCT可以作为评估HFRS病情严重程度及病死率的预测因子,CRP在评估HFRS合并细菌感染中的意义更大。3.HNTV结构蛋白NP与Gc转染细胞转录组测序分析:“细胞因子风暴”可能是汉坦病毒发病机制的关键因素,本研究拟通过体外构建融合GFP标签的NP与Gc真核表达载体,并将其转染至人肾上皮细胞（HEK293T）,以GFP空白质粒为对照,分选GFP阳性细胞进行转录组分析,利用生物信息学分析相关蛋白过表达导致的细胞转录组变化,探讨汉坦病毒炎症风暴机制。NP组、Gc组和对照GFP组共9个样品的转录组分析,共获得70.24 Gb的数据量,各样品均达到6.58 Gb以上,Q30碱基百分比在93.93%以上。本次分析检测到表达基因共35304个,其中已知基因34838个,新基因466个;表达转录本共176196个,其中已知转录本155323个,新转录本20873个。转录组差异基因分析表明转染Gc蛋白组共有3329个差异表达基因（DEGs）,其中1567个DEGs表达上调,1762个DEGs表达下调;转染NP蛋白组共有3595个差异表达基因（DEGs）,其中1744个DEGs表达上调,1851个DEGs表达下调。与GFP对照组相比,NP与Gc组具有很多共同调控的基因,如上调的神经发育相关基因Nefm和Ina,黑素瘤相关抗原（melanoma-associated antigen,MAGE）家族基因Magea1、Magea2、Magea3、Magea6和Magea2b;以及下调的干扰素信号通路相关基因Ifit2、Ifit3、Ddx58、Ifnb1和Bst2,我们推测汉坦病毒NP与Gc蛋白通过抑制干扰素信号通路基因表达,使病毒更容易在宿主细胞内复制及扩散,进而刺激免疫细胞分泌更多的炎症因子,最终导致“细胞因子风暴”。4.HNTV结构蛋白NP与Gc干扰素抑制机制:转录组测序结果提示汉坦病毒NP与Gc蛋白能够抑制干扰素信号通路相关基因表达,我们通过荧光定量PCR（q PCR）实验对差异表达基因进行验证,结果显示Gc和NP能够显著抑制Ifnb1、Ifit1和Tfnsf4表达。为明确HTNV Gc和NP是否通过靶向RLRs（包括RIG-I和MDA5）信号通路抑制干扰素抗病毒反应,我们利用荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀等技术,研究HTNV Gc和NP对干扰素信号通路关键靶点分子（RIG-I和MDA5、TBK1/IRF3磷酸化、MAVS、TRIM25）的调控作用,结果表明HTNV NP与Gc能够抑制RIG-I和MDA5诱导的干扰素产生,不能抑制MAVS诱导的干扰素产生,说明病毒蛋白的靶点分子位于MAVS上游,最后,我们发现HTNV Gc和NP通过靶向E3泛素连接酶TRIM25抑制RLRs信号通路诱导的I型干扰素产生。综上,经吉林省2113例HFRS临床病例分析,发现高龄,多期重叠,白细胞、血小板、尿素氮、肌酐、乳酸脱氢酶和α-羟丁酸酶可以作为早期预测疾病严重程度的参考指标;腹部超声示胰腺炎、腹腔积液及胆囊壁水肿,可以作为预测HFRS重症的危险因素;血清铁蛋白和PCT可以作为评估HFRS病情严重程度及病死率的预测因子,CRP在评估HFRS合并细菌感染中的意义更大。HTNV Gc和NP蛋白通过靶向E3泛素连接酶TRIM25抑制RLRs信号通路诱导的I型干扰素产生。研究结果为HFRS的临床诊断、辅助检查、预后评估以及HTNV的致病机制提供了依据。