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PCR是分子生物学中最重要的工具之一。在PCR技术中,DNA聚合酶起着关键性作用。Taq DNA酶是从嗜热杆菌中分离纯化得到的第一个用于PCR的热稳定性DNA聚合酶。Pfu DNA酶具有3’-5’外切酶活性,是保真度最高的DNA聚合酶之一。本文主要研究从重组工程菌中分别提取Pfu DNA聚合酶及Taq DNA聚合酶。 以重组表达质粒p-Taq转化宿主菌E. coli DH5á,获得转化子。利用Taq酶的热稳定性,将破胞液在75℃水浴1h,然后用硫酸铵沉淀法获得纯化的表达蛋白。对重组E.coli的培养条件进行优化,优化培养条件为:在OD600=0.8时加入IPTG诱导,IPTG的终浓度为125mg/L,诱导培养时间为9h,诱导培养温度为37℃。在优化条件下,1L发酵液可得50,000单位的聚合酶,比活可达10,000U/mg蛋白质。 用Pfu DNA聚合酶的表达质粒pET-Pfu（表达载体为pET11）转化大肠杆菌BL21（DE3）（含有pLysS质粒）得到重组工程菌。在Pfu酶的纯化过程中,用溶菌酶裂解细胞,利用Pfu酶的热稳定性,采用热变性法（冻融法）除去绝大部分杂质蛋白,得到Pfu酶粗溶液。然后尝试使用磷酸纤维素P11、CM-Sepharose CL-6B、DEAE-Sepharose FF、JK110等几种离子交换树脂,及葡聚糖凝胶G-200、Sephacry1 S-200、Sephadex G-100、Sephadex G-75等几种凝胶树脂,来进一步纯化Pfu酶。研究用无毒价廉的乳糖代替IPTG作诱导剂,并对诱导条件进行了优化,优化条件为:培养液接种后立即加入1g/L的乳糖,诱导培养8h后收获菌体。用优化后的培养条件及纯化技术,在实验室环境中制备重组Pfu DNA聚合酶。将破胞液在75℃水浴20 min,然后依次过JK110离子交换柱和Sephadex G-75凝胶柱得到纯化Pfu酶。在PCR扩增实验中,纯化产品具有与商品酶类似的活性和扩增效果,从500ml培养液中共得到3×105U的聚合酶,纯化Pfu酶比活达到22,200U/mg,浓度为10U/ì 1。