小麦CMS育性相关基因TaGA-3的表达和功能验证

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小麦(Triticum aestivum L.)作为世界上重要的粮食作物之一,在产量、品质和农艺性状等诸多方面都不同程度地表现出杂种优势。杂种优势是生物界一种普遍现象,是提高作物产量、改良作物品质的一条重要且有效的途径。细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)是利用杂种优势的重要手段,广泛应用于小麦杂种优势和杂交制种。植物激素作为植物体内广泛存在的一类痕量信号分子,低浓度便可调节植物的生理反应。目前,从植物内源激素的动态平衡来研究育性转换已成为雄性不育研究领域的一个重要课题。因此,本研究初步探索了赤霉素调控的基因与小麦育性的关系。利用分子标记对五种同核异质雄性不育(IAMSLs)材料(K87B1-706A、U87B1-706A、Va87B1-706A、C687B1-706A、Ju87B1-706A)及其同型保持系(87B1-706B)的核型和异源胞质进行鉴定。对六种材料的花药进行转录组测序、q RT-PCR分析以及小麦进行激素处理,获得一个赤霉素调解家族蛋白的基因(Ta GA-3)。通过序列分析、进化树分析、亚细胞定位、外源喷施不同浓度的赤霉素和大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默(BSMV-VIGS)技术对候选基因的功能进行初步探索,获得以下主要研究结果:1、本章以五种同核异质雄性不育系及其同型保持系为材料,利用分子标记对遗传背景和异源胞质进行鉴定。遗传背景鉴定发现,每一对SSR引物都能扩增出带型和大小一致的基因组DNA片段,说明他们的遗传背景都是706核型;利用同样的方法对叶绿体DNA(cp DNA)进行鉴定,发现同一叶绿体SSR(cp SSR)引物在扩增六种材料的叶绿体DNA时呈多态性,说明他们的细胞质来源不同。2、分析六种材料花药的转录组(RNA-sep)数据,筛选到8个在花药中差异表达的、分别参与激素(生长素,赤霉素,茉莉酸)信号通路的差异表达基因(DEGs)。利用花药(混合各时期)定量,确定了生长素和赤霉素类基因。通过对不育系和恢复系分别喷施同一浓度(500 ng/μl)的生长素和赤霉素,统计结实率发现恢复系材料的结实率都有不同程度的降低,其中,Ju87B1-706R的结实率降低幅度最大,作为后期的试验材料。对赤霉素3个同源基因在Ju87B1-706R和Ju87B1-706A的时空表达模式进行分析,获得了目的基因Ta GA-3。3、对Ju87B1-706R和Ju87B1-706A进行雄蕊和花药的表型观察,发现在三核期,Ju87B1-706R的花丝伸长,花药开裂并且有花粉粒散出,Ju87B1-706A花药不开裂。碘化钾染色表明,Ju87B1-706A花粉粒形状不规则,染色不充分,属于典败和染败类型。DAPI染色发现,Ju87B1-706R花粉粒在三核期时出现两个梭形的精核和一个即将分解的圆形营养核,Ju87B1-706A花粉粒在各个时期都粘连在一起,三核期出现三个圆形的细胞核。以上结果表明,Ju87B1-706A为一种雄性不育材料,完全符合雄性不育的特点。4、以Ju87B1-706A和Ju87B1-706R为模板,成功分离基因Ta GA-3,序列分析表明该基因在Ju87B1-706A和Ju87B1-706R中的序列并无差异。Ta GA-3的亲缘关系分析表明该基因与AK336180.1关系最近,但是AK336180.1的功能还未见报道。亚细胞定位表明该基因定位于细胞核、细胞膜或细胞壁上。对Ju87B1-706R外源喷施不同浓度的赤霉素(50 ng/μl,500 ng/μl,1000 ng/μl),发现随着喷施浓度增高,内源赤霉素的含量和目的基因的表达量逐渐增高,结实率却逐渐降低,说明内源激素的动态平衡对基因的表达量和结实率都有影响。5、对喷施GA(1000 ng/μl)的Ju87B1-706R进行BSMV-VIGS试验,发现GA-CK、GA-γ、GA-γ-PDS的小花和花药变得瘦小、干瘪、不开裂,花药甚至呈透明状,而CK(未喷施GA)和GA-γ-Ta GA-3的小花和花药却是正常的,能被碘化钾染成深色,三核期的DAPI染色中有两个梭形的精核出现,表现可育。而GA-CK、GA-γ、GA-γ-PDS的碘化钾染色和DAPI染色证明它们的花粉粒是不育的,这与表型观察的结果一致,定量和结实率也再次验证了这个结果。以上结果表明赤霉素相关基因Ta GA-3确实与育性有关。
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