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目的间质性肺疾病(Interstitial Lung Disease,ILD)近年来发病率和死亡率呈明显上升趋势,晚期肺纤维化是共同结局。该疾病发病率为3-6/10万,其中50%的IPF病人在确诊后4-5年死亡,死亡率与肺癌相似,严重威胁人群健康和影响生活质量。因此,积极研究肺纤维化发生机制,探索防治肺纤维化新途径,已成为肺科学界研究的热点和难点。尽管肺纤维化发病机制目前尚不完全清楚,但随着细胞生物学和分子生物学研究不断深入,对肺纤维化的发生、发展机制有了许多新得认识,肺纤维化机制的研究正逐渐走向整体化和多学科交叉方向。Wnt信号途径是发育生物学中的重要信号分子,它在哺乳动物肺脏发育中起重要作用。基因敲除实验证实:Wnt2a基因敲除鼠没有发育出肺脏的轮廓;Wnt5a基因敲除鼠在肺脏发育后期无法最后完成肺脏成熟,小鼠因此而死亡。许多证据表明β-catenin(β-连环素)活化促进纤维化疾病的发生。侵袭性纤维瘤病是一种良性克隆性纤维细胞增生疾病,在散发病人的组织病理切片中发现β-catenin向细胞核内浓聚,即向核内转移启动下游基因转录。文献报道IPF病人受损支气管基底细胞和损伤部位Ⅱ型上皮细胞中发现β-catenin向细胞核内转移。肺纤维化研究发现Wnt信号下游效应基因—MMP-7直接参与了肺纤维化的发生、发展。Wnt/β-catenin信号和TGF-β通路存在多个环节相连通,TGF-β(转化生长因子β,TGF-β)可以直接激活TCF/LEF(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)转录目的基因。因此,本课题拟利用基因转染、RT-PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和蛋白印迹(Western Blotting,WB)等实验技术探讨β-catenin对成纤维细胞有何作用及作用机制。方法利用cDNA文库经PCR扩增获得人截短beta catenin基因,构建质粒SCAT—pcDNA3.0;利用Sofast转染试剂将SCAT—pcDNA3.0质粒转染入人胚肺成纤维细胞(HELF),收集细胞分别在mRNA和蛋白水平观察如下指标:游走性,胶原Ⅰ、Ⅲ合成量,α平滑肌肌动蛋白、上皮钙粘连蛋白、MMP-7合成状态。结果分析以电泳条带上灰度值作为表达产物水平的参数。应用SPSS10.0统计分析软件对实验数据进行统计分析。显著检验水准α值取0.05。结果用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切PCR产物并回收该片段。将该片段连接到同样被KpnⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.0载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细菌,挑取阳性克隆进行质粒提取,进行酶切鉴定,并获得阳性克隆。重组质粒测序分析结果与Genebank内β-catenin序列比较,结果表明没有错配。使用转染试剂Sofast将构建成功表达质粒、pcDNA3.0质粒及对照质粒pEGFP-N1转染入人胚肺成纤维细胞,倒置荧光显微镜下观察对照组出现绿色荧光。RT-PCR及Western Blot检测β-catenin及新霉素抗性基因表达显示:正常细胞及转染空质粒细胞有少量β-catenin表达,而转染SCAT—pcDNA3.0质粒的HELF细胞有强烈的β-catenin表达;新霉素抗性基因在HELF细胞中无表达,但在转染空载体和转染SCAT—pcDNA3.0质粒的HELF细胞中有较强的表达。转染SCAT—pcDNA3.0HELF细胞合成胶原Ⅰ较HELF细胞及转染空载体细胞增加,而胶原Ⅲ的合成在转染空载体细胞及HELF细胞有较小区别,但在转染重组质粒细胞中有较高表达。Wnt/β-catenin下游基因MMP-7(matrix metalloproteinas 7/matrilysin,MMP-7),cyclin D1表达增加,MMP-9(matrix metalloproteihas 9)表达没有变化。转染重组质粒HELF细胞合成a-SMA(a平滑肌蛋白,a-SMA)增加,但E-cadherin(上皮型钙粘连素,E-cadherin)合成明显减少。转染SCAT—pcDNA3.0细胞游走性明显增加。结论1.β-连环素促进胶原合成在肺纤维化发生中起一定作用。2.β连环素通过高表达MMP-7、cyclin D1、a-SMA、降低上皮型钙粘连素表达发挥致肺纤维化作用。3.β连环素增加成纤维细胞游走性促进肺纤维化发生。