论文部分内容阅读
目的间质性肺疾病（Interstitial Lung Disease，ILD）近年来发病率和死亡率呈明显上升趋势，晚期肺纤维化是共同结局。该疾病发病率为3-6／10万，其中50％的IPF病人在确诊后4-5年死亡，死亡率与肺癌相似，严重威胁人群健康和影响生活质量。因此，积极研究肺纤维化发生机制，探索防治肺纤维化新途径，已成为肺科学界研究的热点和难点。尽管肺纤维化发病机制目前尚不完全清楚，但随着细胞生物学和分子生物学研究不断深入，对肺纤维化的发生、发展机制有了许多新得认识，肺纤维化机制的研究正逐渐走向整体化和多学科交叉方向。Wnt信号途径是发育生物学中的重要信号分子，它在哺乳动物肺脏发育中起重要作用。基因敲除实验证实：Wnt2a基因敲除鼠没有发育出肺脏的轮廓；Wnt5a基因敲除鼠在肺脏发育后期无法最后完成肺脏成熟，小鼠因此而死亡。许多证据表明β-catenin（β-连环素）活化促进纤维化疾病的发生。侵袭性纤维瘤病是一种良性克隆性纤维细胞增生疾病，在散发病人的组织病理切片中发现β-catenin向细胞核内浓聚，即向核内转移启动下游基因转录。文献报道IPF病人受损支气管基底细胞和损伤部位Ⅱ型上皮细胞中发现β-catenin向细胞核内转移。肺纤维化研究发现Wnt信号下游效应基因—MMP-7直接参与了肺纤维化的发生、发展。Wnt／β-catenin信号和TGF-β通路存在多个环节相连通，TGF-β（转化生长因子β，TGF-β）可以直接激活TCF／LEF（T cell factor／lymphoid enhancer factor，TCF／LEF）转录目的基因。因此，本课题拟利用基因转染、RT-PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）和蛋白印迹（Western Blotting，WB）等实验技术探讨β-catenin对成纤维细胞有何作用及作用机制。方法利用cDNA文库经PCR扩增获得人截短beta catenin基因，构建质粒SCAT—pcDNA3.0；利用Sofast转染试剂将SCAT—pcDNA3.0质粒转染入人胚肺成纤维细胞（HELF），收集细胞分别在mRNA和蛋白水平观察如下指标：游走性，胶原Ⅰ、Ⅲ合成量，α平滑肌肌动蛋白、上皮钙粘连蛋白、MMP-7合成状态。结果分析以电泳条带上灰度值作为表达产物水平的参数。应用SPSS10.0统计分析软件对实验数据进行统计分析。显著检验水准α值取0.05。结果用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切PCR产物并回收该片段。将该片段连接到同样被KpnⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.0载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，挑取阳性克隆进行质粒提取，进行酶切鉴定，并获得阳性克隆。重组质粒测序分析结果与Genebank内β-catenin序列比较，结果表明没有错配。使用转染试剂Sofast将构建成功表达质粒、pcDNA3.0质粒及对照质粒pEGFP-N1转染入人胚肺成纤维细胞，倒置荧光显微镜下观察对照组出现绿色荧光。RT-PCR及Western Blot检测β-catenin及新霉素抗性基因表达显示：正常细胞及转染空质粒细胞有少量β-catenin表达，而转染SCAT—pcDNA3.0质粒的HELF细胞有强烈的β-catenin表达；新霉素抗性基因在HELF细胞中无表达，但在转染空载体和转染SCAT—pcDNA3.0质粒的HELF细胞中有较强的表达。转染SCAT—pcDNA3.0HELF细胞合成胶原Ⅰ较HELF细胞及转染空载体细胞增加，而胶原Ⅲ的合成在转染空载体细胞及HELF细胞有较小区别，但在转染重组质粒细胞中有较高表达。Wnt／β-catenin下游基因MMP-7（matrix metalloproteinas 7／matrilysin，MMP-7），cyclin D1表达增加，MMP-9（matrix metalloproteihas 9）表达没有变化。转染重组质粒HELF细胞合成a-SMA（a平滑肌蛋白，a-SMA）增加，但E-cadherin（上皮型钙粘连素，E-cadherin）合成明显减少。转染SCAT—pcDNA3.0细胞游走性明显增加。结论1．β-连环素促进胶原合成在肺纤维化发生中起一定作用。2．β连环素通过高表达MMP-7、cyclin D1、a-SMA、降低上皮型钙粘连素表达发挥致肺纤维化作用。3．β连环素增加成纤维细胞游走性促进肺纤维化发生。