目的观察虎杖苷(Polydatin,PD)对百草枯(Paraquat,PQ)中毒大鼠肺湿干比(Wet-to-dry weight ratio,W/D)改变,血浆和各组织PQ浓度、肺组织及血清脂质过氧化产物(Lipid peroxidation,LPO)和炎症细胞因子水平的影响,探索其对急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的保护作用,为临床应用PD治疗PQ中毒ALI提供理论基础。方法(1)实验一:建立适合本研究的急性百草枯中毒大鼠模型。取健康雌性SD大鼠32只,体重约(200±20)g,按正常生活条件适应性喂养2天后,禁食不禁水12h,同时观察大鼠无异常情况后称体重,并按数字随机分组法分成4组,正常对照组、各剂量染毒组(每组8只);正常对照组生理盐水1ml/kg灌胃,各染毒组分别以20%PQ液按质量分数低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高(75mg/kg)三种剂量进行一次性灌胃。染毒后予以普通正常喂养7天,期间不作任何处理。每天上午固定时间观察各组大鼠的一般情况,包括有无精神反应萎靡、口鼻唇四爪发绀、呼吸困难及病理呼吸音、进食进水排泄情况的异常、攻击性活动降低、毛色蓬松黯淡、出血及死亡或存活等综合情况并详细记录,8天后将所有存活大鼠全部予以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉处死,解剖胸腔取肺组织,PBS缓冲液(pH值为7.3、0.1mol/L)反复冲冼,10%甲醛溶液固定,4℃冰箱保存待行肉眼大体病理学及病理HE染色观察肺部情况,同时计算各染毒组大鼠的生存率,从而得出适合本研究染毒模型PQ的最佳剂量。(2)实验二:紫外分光光度法检测血清中百草枯方法的建立选用清洁级健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,体重约(200±20)g,将所有大鼠随机分为正常对照组(n=5)和染毒组(n=25)。采取一次性灌胃法构建动物模型:染毒组以20%百草枯水剂按25mg/kg;对照组给予等量1mL/kg生理盐水;给药后每组采样时间(于6h、12h、24h、48h、72h五个时间点,每组5只),以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉处死,分别解剖采集血清600μL与20%三氯乙酸100μL混匀以12000r/min离心10min取0.2ml的上清液,加1.8mL的蒸馏水进行紫外分光光度法(ultravioletspectrophotom-etry,Uv)测定其中百草枯的含量。本实验采取低温高速离心、20%三氯乙酸直接沉淀杂质蛋白分离提取中毒大鼠血浆或组织中的PQ浓度,建立Uv定量方法。用所建立的Uv检测方法,对PQ中毒大鼠的血浆、或肺、心、肝、肾进行检测,以为下一步实验探讨血浆或组织中的PQ浓度与中毒预后的关系奠定基础。(3)实验三:虎杖苷对急性百草枯中毒大鼠肺损伤的治疗作用为评价PD对PQ致大鼠急性中毒的治疗作用,选用健康雌性SD大鼠80只,体重约(200±20)g,随机分为分为3组:正常对照组(n=20)、染毒组(n=30)和PD干预组(n=30)。根据预实验结果,染毒组和PD干预组均以20%百草枯水剂按25mg/kg一次性灌胃,建立大鼠百草枯中毒模型。PD干预组大鼠在染毒后60min给予120mg/kg虎杖苷干预药物灌胃,染毒组及正常对照组大鼠给予等量1ml/kg生理盐水灌胃,之后每日1次,共连续给药3天。分别于试验开始后6h、12h、24h、48h、72h观察每组大鼠中毒反应,并麻醉处死(每时间点染毒组和PD干预组6只,正常对照组4只),收集血清和各组织标本-80℃冰箱保存待检。生化法严格按各试剂盒说明书检测大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)含量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、白介素-6(IL-6)的水平及变化规律;同时留取部分肺组织分别检测核因子-κB(NF-κB)、羟脯氨酸(HYP)及湿/干重比值(W/D)观察肺组织纤维化程度;紫外分光光度法(Ultravioletspectrophotometry,Uv)检测血清和各组织中PQ水平,评估PD对各组织内PQ的清除作用。结果(1)实验一:正常对照组全部大鼠在观察期内无明显变化,进食进水正常,行动反应敏捷,毛发光滑洁净,四肢体肌力正常,体重明显增加;经造模后,各染毒组大鼠均于2h后逐渐开始出现中毒症状,逐渐显现不同程度精神呆滞、进食饮水量减少、行动反应迟缓、皮毛干涩蓬松、四肢体肌力明显下降、呼吸急促等现象;于染毒后1~3d上述症状显著加重,是大鼠死亡的高峰期;以低剂量组反应最轻,而中、高剂量组则出现不同程度口鼻唇有血性分泌物及肢体末端紫绀现象,并逐渐出现呼吸困难等缺氧表现,症状严重者死亡。从病理HE染色来看,所有染毒大鼠肺内均有肺间质增厚、炎性细胞浸润、纤维蛋白渗出增加,大量肺泡结构萎陷破坏等病理改变,低剂量组病理变化较中、高剂量组相似,但程度较轻,均可认为达到制备急性PQ中毒大鼠模型的要求。本研究的预实验设计的实验周期为1周,从大鼠死亡率来看,高剂量组在7天内死亡7只,中剂量组在7天内死亡6只,而小剂量组则在7天内,死亡1只。综合来看,符合我们进行预实验的时间上的要求应以25mg/kg的染毒剂量进行染毒,故采用25mg/kg的染毒剂量来制备急性PQ中毒大鼠染毒模型。(2)实验二:Uv法定量检测染毒大鼠血清中PQ浓度线性范围为在0.08~10μg/mL,回归方程为y=0.0935x+0.2964,其相关系数(r)为0.9955,回收率为90.63%~103.0%,RSD为3.6%~8.12%,日内及日间RSD波动于1.1%~5.19%和2.2%~6.04%,检测下限为0.05μg/mL。根据标准曲线回归方程计算不同时间点血清PQ浓度,由此可见血清中PQ浓度早期至6h到达高峰之后逐渐下降,至72h仍可在血清中检测出PQ,说明其在血清中的浓度可以有助于判断中毒预后。在样本处理过程中,Uv法采用三氯乙酸直接沉淀蛋白的方法处理大鼠血清样本,可靠性较高,杂峰干扰少,具有操作简便快捷,分析快速,结果准确。(3)实验三:除对照组外,各组大鼠中毒症状相似。1.PD对实验动物一般情况观察结果的影响:正常对照组,全部大鼠在72h实验期内无任何异常变化,表现良好,实验期间体重平稳增加,染毒组大鼠出现不同程中毒症状,PD干预组症状出现相对较晚,较同时间点染毒组明显减轻,症状均有不同程度改善。2.PD对实验动物的体重变化的影响:染毒组大鼠染毒后体重则随着染毒时间的延长呈下降趋势,明显低于正常对照组,PD干预组在给予药物干预后,延缓了中毒大鼠体重下降的趋势,与染毒组大鼠体重比较有明显的统计学差异。3.PD对实验动物肺湿干重比(W/D)水平的影响:在对应时间点染毒组肺W/D随着中毒时间延长而逐渐明显高于对照组,PD干预组与染毒组比较,各时间点W/D水平升高幅度明显降低有统计学意义。4.PD对实验动物血清及各组织中PQ浓度的影响:染毒后不同时间在血、肺、心、肝、肾中PQ分布及含量有明显差异,均较正常对照组显著升高,PD干预后各时间点均明显低于染毒组,然后呈现出随着时间的延长逐渐下降的趋势,但仍然明显高于正常对照组。5.PD对实验动物血清中脂质过氧化反应指标物水平的的影响:染毒组和PD干预组各时间点血清MDA、MPO含量均高于正常对照组,具有显著差异性(P<0.05或P<0.01),而CAT、SOD、GSH-PX含量均低于正常对照组(P<0.05或P<0.01);PD干预组各时间点血清MDA、MPO水平较染毒组降低,抗氧化物的酶类CAT、SOD、GSH-Px氧化还原系统水平,且随着时间的延长而增加,逐渐较染毒组升高(P<0.05或P<0.01)。6.PD对实验动物血清及肺组织中炎症细胞因子含量的影响:与正常对照组比较,染毒组各时间点肺组织HYP、NF-κB含量呈逐渐增高趋势(P<0.05或P<0.01),PD干预组与染毒组比较,肺组织HYP、NF-κB含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与正常对照组比较,染毒组各时间点血清中TGF-β1、IL-6、TNF-α均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与染毒组比较,PD干预组血清中TGF-β1、IL-6、TNF-α含量在各时间点升高幅度明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论本实验采用一次性灌胃方法成功建立了急性PQ中毒大鼠模型。鉴于紫外分光光度法的实用性、可靠性较高,可以稳定用于大鼠中毒模型的血液样本PQ浓度的多次检测。PQ中毒大鼠随着时间的延长,血液PQ浓度极低或检测不到,所以,血液PQ浓度或许不能单独作为判断其中毒严重程度以及预后的指标。PD可以明显减轻肺干湿比、血浆和各组织PQ浓度、减轻肺组织及血清脂质过氧化物和炎症因子在急性PQ中毒大鼠组织及血浆中的水平,来减轻PQ所致的急性肺损伤反应,可能与其有较强的抗氧化应激、抑制炎症因子释放等功能有密切关系,具有良好的临床应用前景。