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目的:获得重组E2包膜蛋白和NS3重组蛋白,检测其抗原性,利用HCV抗原建立HCV抗体检测方法,确立最佳反应体系,提高 HCV抗体检测灵敏度与特异性。 方法:用Biosun计算机辅助软件对HCV E2表位进行分析,确定抗原性强的氨基酸序列,针对该序列设计HCV E2引物,从HCV病人抗原阳性血清中抽提RNA,经逆转录合成cDNA,PCR扩增目的基因片段,将其插入pMD-18克隆载体,通过克隆扩增后,提取阳性克隆质粒,经PCR、双酶切和测序鉴定;将HCV E2基因连接到pET41a表达载体,构建重组质粒pET41a-HCV E2,然后转化至宿主菌BL21中进行诱导表达,利用SDS-PAGE与 Western-Blot进行分析和鉴定表达产物,Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白HCV E2。检测其抗原性并将E2和NS3重组抗原建立单片段抗原ELISA检测,分别从包被缓冲液,聚苯乙烯微孔板,封闭液,样本稀释液,标本稀释度,酶滴度,标本包被体积等方面,优化实验条件,然后将E2、NS3辅助抗原及其它抗原作为包被抗原检测病人血清中HCV抗体,根据确定的最佳反应体系,进行小量临床样本检测,最后进行数据统计学分析。 结果:PCR成功扩增出HCV E2基因片段(约600bp),测序结果与目的基因序列完全相符。构建了重组质粒pET41a-HCV E2,并在大肠杆菌BL21菌中高效表达出Mr约为22 kDa的HCV E2重组蛋白,超声裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得纯度在95％以上的HCV E2。纯化后获得E2蛋白浓度为0.4mg/ml,用E2蛋白和NS3做为包被抗原对本室20份HCV阳性、20份HCV阴性质控血清进行检测,在20份HCV阳性标本中,NS3检出12份,检出率为60%(12/20),E2检出7份,检出率为35%(7/20),阴性则全部检出为阴性。E2、NS3辅助抗原混合后作为包被抗原,对192份血清标本进行ELISA,检测结果与PCR法检出率相似,两种检测结果没有显著差异。通过对抗原抗体反应体系的优化,确定E2和NS3的工作浓度分别为0.025μg/well,0.1μg/well,缓冲盐包被液为pH值9.6的碳酸盐缓冲液,酶标二抗(HRP标记的鼠抗人IgG)浓度为1:5000,包被体积为100μl,包被方式为NS3先包被较其它方式好。 结论: 1.成功克隆HCV E2基因,并构建了pET41a-HCV E2原核表达载体和高效表达出Mr约22kDa的重组蛋白。 2.利用HCV E2和NS3抗原进行了HCV抗体检测的初步应用;并优化了NS3和E2对HCV抗体检测的ELISA反应体系,增加了HCV抗体检测灵敏度和特异性。