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目的采用棕榈酸酯(Palmitic acid,PA)刺激THP-1起源的巨噬细胞,构建动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)炎性泡沫细胞模型,考察荜茇宁(Piperlonguminine,GBN)及其两个衍生物GBNT、GBNX对巨噬细胞泡沫化和炎症的调节作用,并通过检测药物对泡沫细胞内脂质摄入和流出调控基因和自噬-NLRP3炎性小体轴的影响,初步探索荜茇宁及其衍生物的抗AS的作用机制。方法采用MTS法检测GBN、GBNT、GBNX对巨噬细胞活率的影响,在药物的无毒范围内选择合适的给药浓度。利用佛波酯(Phorbol ester,PMA)将THP-1细胞诱导分化为巨噬细胞,然后采用PA刺激THP-1起源的巨噬细胞建立炎性泡沫细胞模型,将其分为模型组(Model组)和药物干预组;药物干预组又分为辛伐他丁(Simvastatin,Sim)阳性对照组(1umol/L)、GBN组(4μmol/L)、GBNT组(4μmol/L)和GBNX组(4μmol/L)。处理24h后,收集细胞上清液及细胞,检测各指标变化。1、油红O染色检测各组细胞内脂质的蓄积,探索荜茇宁及其衍生对泡沫细胞形成的影响。2、酶比色法测量各组细胞内胆固醇含量,并计算胆固醇酯与总胆固醇比值,探索荜茇宁及其衍生对细胞内胆固醇酯的影响。3、RT-PCR法检测巨噬细胞清道夫受体SR-A、LDLR、CD36和胆固醇外流转运体SR-BI、ABCA1、ABCG1 mRNA的表达,探索荜茇宁及其衍生调节巨噬细胞泡沫化的可能途径。4、ELISA法和RT-PCR检测巨噬细胞上清液和细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的含量,探索荜茇宁及其衍生对炎症的影响。5、DCFH-DA荧光探针法检测巨噬细胞内ROS含量,探索荜茇宁及其衍生的抗氧化作用。6、Western Blot法检测细胞裂解液中NLRP3、Caspase-1(P20)、IL-1β、LC3B、P62、SIRT3和SOD2蛋白表达,探索荜茇宁及其衍生物抑制泡沫细胞炎症反应的可能机制。结果1、采用200ng/mL的PMA刺激THP-1细胞72h,将其诱导分化为巨噬细胞,该浓度诱导形成的巨噬细胞贴壁率也较高且形态典型完整。油红染色结果显示用20μmol/L的PA刺激THP-1起源的巨噬细胞24小时,能使细胞内脂滴增多,脂质含量显著增加(P<0.01),差异具有统计学意义,即可成功建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型。2、MTS结果显示,GBN、GBNT和GBNX对THP-1起源巨噬细胞的增殖均有一定抑制作用,但低浓度影响较小,荜茇宁及其衍生物在浓度≤16μmol/L时均对THP-1起源巨噬细胞无毒,因此选择浓度≤10μmol/L的荜茇宁和荜茇宁衍生物进行后续实验。3、油红染色结果显示GBN、GBNT和GBNX能显著减少泡沫细胞内脂质的蓄积(P<0.01);酶终点法测定结果显示,PA刺激使巨噬细胞内总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(free cholesterol,FC)、胆固醇酯(cholesterol ester,CE)含量显著增加(P<0.001),CE/TC比值达54.6%,而GBN、GBNT和GBNX均能使细胞内CE/TC比值显著下降(P<0.001,P<0.01),分别为36.7%、38.4%和39.2%。4、实时定量PCR法检测结果显示,PA刺激导致THP-1巨噬细胞清道夫受体SR-A、LDLR、CD36表达显著升高(P<0.001),而GBN、GBNT和GBNX均能使SR-A、LDLR和CD36的mRNA表达显著下降(P<0.001,P<0.01,P<0.05),同时使巨噬细胞胆固醇外流转运体SR-BI、ABCA1、ABCG1的mRNA表达显著升高(P<0.001,P<0.01,P<0.05),从实验结果还可以看出,无论是抑制巨噬细胞对脂质的摄取,还是促进巨噬细胞胆固醇外流,GBN的效果都是最好的。5、ELISA法和实时定量PCR法检测结果显示,PA刺激使THP-1巨噬细胞培养上清和细胞内IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均显著升高(P<0.001);而GBN、GBNT和GBNX处理后,细胞培养上清和细胞内IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均显著下降(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。对比实验结果发现,GBN的抗炎效果比其衍生物要好。6、DCFH-DA探针法检测结果显示,THP-1巨噬细胞经PA刺激后,细胞内ROS水平显著升高(P<0.001),加入GBN、GBNT和GBNX处理后,PA诱导增加的细胞内ROS水平被显著抑制(P<0.001,P<0.01)。7、Western Blotting结果显示,PA刺激后,巨噬细胞内SOD2表达显著升高(P<0.01);经GBN、GBNT和GBNX处理后,GBN组和GBNT组SOD2表达显著下降(P<0.05),GBNX组SOD2表达呈下降趋势,但与Model组比较,无显著差异。进一步研究发现,与Control组相比,20μmol/L的PA使巨噬细胞内SOD2表达显著增加(P<0.01),而当PA浓度增加到250μmol/L时,SOD2表达显著降低(P<0.05),8、Western Blotting结果显示,PA刺激导致THP-1巨噬细胞内NLRP3、Caspase1和IL-1β表达均显著升高(P<0.001,P<0.01),经GBN、GBNT和GBNX处理后,各给药组NLRP3、Caspase1和IL-1β表达显著下降(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。9、Western Blotting结果显示,PA刺激导致THP-1巨噬细胞内自噬相关蛋白LC3II/I比值略升高,但与Control组相比无显著差异;同时,使P62的表达显著升高(P<0.001)。而经GBN、GBNT和GBNX处理后,各组LC3II/I比值均显著升高(P<0.01,P<0.05),P62表达均显著下降(P<0.01,P<0.05)。10、Western Blotting结果显示,PA刺激导致THP-1巨噬细胞内自噬调控蛋白SIRT3表达略升高,但与Control组相比无显著差异;经GBN、GBNT和GBNX处理后,各组SIRT3的表达均显著增加(P<0.05)。11、Western Blotting结果显示,巨噬细胞仅用GBN、GBNT和GBNX处理后,与Control组相比,细胞内SIRT3表达显著升高(P<0.01,P<0.05),LC3II/I比值也显著升高(P<0.01,P<0.05)。结论1、THP-1单核细胞通过200ng/mL的PMA刺激72h可分化为形态典型且完整的巨噬细胞,再经20μmol/L的PA刺激24h,可分化为泡沫细胞。2、在0-16μmol/L的浓度范围内,GBN对THP-1巨噬细胞无毒性;在0-32μmol/L的浓度范围内,GBNT和GBNX对THP-1巨噬细胞无毒性。3、GBN、GBNT和GBNX均能减少细胞内胆固醇酯含量,同时均能通过抑制巨噬细胞清道夫受体SR-A、LDLR、CD36的表达,阻碍巨噬细胞对脂质的摄取,同时促进巨噬细胞胆固醇外流转运体SR-BI、ABCA1、ABCG1表达,调节胆固醇逆转运过程,减少巨噬细胞内脂质的蓄积,进而抑制巨噬细胞泡沫化。4、GBN、GBNT和GBNX可以抑制PA刺激下巨噬细胞泡沫化过程中炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的表达和释放,提示荜茇宁及其衍生物具有抗炎作用,而其发挥抗炎作用的机制可能是通过直接清除ROS,或通过增加SIRT3的表达来促进巨噬细胞自噬,进而抑制NLRP3炎症小体的激活,以此发挥抗AS的作用。5、GBN抑制巨噬细胞泡沫化的作用和抗炎作用均优于GBNT和GBNX。