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神经退行性疾病是一类慢性、渐进性神经系统疾病,严重威胁人类的健康。随着人口老龄化的加剧,神经退行性疾病的发病率将会进一步增加。常见的神经退行性疾病有帕金森疾病,阿尔兹海默病和亨廷顿疾病等。这类疾病以中枢神经系统的神经元渐进性变性、死亡为特征。例如,帕金森疾病的发病原因是中脑黑质区域的多巴胺能神经元(Dopaminergic neuron,DA)受损或者死亡,阿尔兹海默病是基底前脑胆碱能神经元(basal forebrain cholinergic neurons,BFCN)变性,而亨廷顿疾病是纹状体区GABA能投射神经元(γ-Aminobutyric acid-ergic projection neuron,GABA)变性或死亡。目前临床上对这类疾病的治疗主要以补充神经递质或神经营养因子为主,没有有效的诊治措施来治疗这类神经退行性疾病。当受损的神经元无法继续存活之后,这些传统的治疗方法将无法继续缓解相应的病症。通过细胞移植的方法,重新恢复缺损的神经回路将是治疗这些疾病的唯一有效途径,而随着干细胞的发现以及研究的不断深入,细胞移植疗法会在治疗神经退行性疾病中得到更加广泛的应用。目的在将人多能干细胞(Human pluripotent stem cell,h PSC)应用在个体发育和疾病研究的过程中,关键是构建合适的分化系统诱导多能干细胞体外分化形成特定的神经前体细胞和神经元。理想的体外分化系统应该是化学成分确定的、高效的、对所分化的细胞类型能加以调控的,并且能够完全反映体内分化发育的相关机制。目前体外诱导h PSC神经分化的系统主要包括两类:悬浮分化系统(Embryoid body(EB)formation differentiation paradigm)和贴壁分化系统(Adherent culture(AD)differentiation paradigm)。多项实验研究报道通过这两种分化系统成功诱导h PSC分化形成内侧神经节隆起(medial ganglionic eminence,MGE)、外侧神经节隆起(Lateral ganglionic eminence,LGE)和基板(Floor plate,FP)。而这些部位的神经前体细胞移植后继续分化形成的功能性GABA能中间神经元、BFCN以及中脑DA神经元可对癫痫、阿尔茨海默病、亨廷顿疾病和帕金森疾病的症状有很好的改善。但是这两类系统对分化成为各类神经元是普遍适用的还是具有特异性,目前尚不清楚。方法1.优化EB分化系统和AD分化系统将h PSC分化形成神经前体细胞和神经元。2.在EB分化系统和AD分化系统中将神经外胚层(Neural-ecoderm,NE)细胞通过腹侧化诱导分子SHH(Sonic Hedgehog)和尾侧化诱导分子RA(Retinoic acid)靶向为不同部位神经前体细胞。3.系统比较EB分化系统和AD分化系统,观察两种分化系统对不同部位神经前体细胞和亚型特异性神经元分化的选择性。4.通过m RNA-Seq转录组的分析研究EB分化系统和AD分化系统导致神经前体细胞和神经元谱系分化差异的具体机制。5.在hPSC系统中建立基因敲除和基因诱导过表达转基因体系,通过转基因细胞系,研究不同分化系统对神经元谱系分化选择性的具体机制。6.通过CRISPR/Cas9系统构建Foxa2-2-e GFP报告细胞系,利用小分子化合物筛选,在EB和AD分化系统中实现细胞谱系分化的调控。结果1.在无外源诱导分子的条件下,优化后的EB分化系统和AD分化系统都可以高效的诱导h PSC分化形成Foxg1+/Pax6+的前脑背侧神经前体细胞和Tuj1+/Tbr1+/VGlu T1+的背侧神经元。2.在EB分化系统和AD分化系统中,SHH可诱导h PSC分化形成Pax6-/Nkx2.1+的腹侧神经前体细胞;RA可诱导细胞分化形成Foxg1-/Hoxb4+的后脑神经前体细胞。3.在EB和AD分化系统中,SHH诱导h PSC腹侧化之后,EB分化系统产生Nkx2.1+/Sox1+/Lhx6+/Lhx8+/Foxa2-/Foxg1+/EN1-的MGE细胞,分化形成的神经元以GABA阳性的中间神经元和CHAT阳性神经元为主,而AD分化系统得到的是Nkx2.1+/Sox1-/Lhx6-/Lhx8-/Foxa2+/Foxg1-/EN1+的FP细胞,主要分化形成TH阳性神经元。4.m RNA-Seq转录组的分析显示EB和AD分化系统中早期分化细胞中在发育相关基因的表达、能量代谢和细胞粘附等多方面的差别决定了不同神经前体细胞和神经元亚型分化命运之间的差别。5.通过CRISPR/Cas9系统构建的Foxg1诱导过表达以及Foxa2、Pax6和Nkx2.1敲除的胚胎干细胞系分化后都不会改变干细胞在两个分化系统之间不同的分化命运。6.通过CRISPR/Cas9系统构建的Foxa2e GFP/W人胚胎干细胞系,结合小分子化合物筛选实验,筛选出JAK2-STAT3信号通路抑制剂AG490和p38 MAPK信号通路抑制剂SB202190可实现FP和MGE分化命运以及相应神经元亚型之间的转换。结论本实验通过实验证实h PSC利用EB分化系统和AD分化系统进行体外神经分化的过程中,在没有任何外源诱导分子的条件下,分化得到的都是前脑背侧部的神经前体细胞。在分化系统中加入激活Shh信号通路之后,h PSC在EB分化系统和AD分化系统都能被诱导产生Pax6-/Nkx2.1+的腹侧化细胞,但是在两种分化系统中形成的却并不是同一种细胞类型。EB分化系统的细胞经过SHH诱导后形成的是MGE的神经前体细胞,经过进一步的神经分化形成GABA和CHAT阳性的神经元;AD分化系统的细胞在SHH诱导之后分化得到的是FP的神经前体细胞,主要分化形成TH阳性的神经元。本研究还通过构建Foxa2的e GFP细胞系来进行小分子化合物的筛选,发现JAK2-STAT3和p38 MAPK信号通路在FP的分化发育中起着关键的作用。使用小分子抑制剂AG490和SB202190抑制分化过程中这两个信号通路的活性,可使细胞的分化命运由原来的FP变成MGE,并进一步促进神经元亚型之间的转变。