金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是一种寄生于动物体表的条件性致病菌,能引起人和多种动物的感染性疾病,如心内膜炎、肺炎、骨髓炎和菌血症等。此外,S.aureus还可引起哺乳期妇女和动物的乳腺炎,严重威胁人类健康和畜牧业健康发展。S.aureus耐药菌株的涌现和疫苗预防效果的局限性使得深入研究其发病的免疫学机制已迫在眉睫。目前,S.aureus乳腺感染的相关免疫调控机制并不完全清楚,最新研究表明,一些非传统的T细胞群（如γδT细胞）参与了病原微生物感染的免疫应答,并且在调节免疫反应类型和强度上发挥重要作用。γδT细胞作为连接固有免疫应答与适应性免疫应答的桥梁,广泛分布于各种黏膜和皮下组织,在黏膜免疫防御中扮演着重要的角色。有研究表明,γδT细胞对细菌感染的免疫应答因感染部位的不同而存在着差异。乳腺作为机体的特殊组织器官,在感染S.aureus后,乳腺组织中γδT细胞动态变化如何?发挥怎样的功能?具体机制如何?尚未见报道。本研究通过S.aureus感染小鼠乳腺模型,系统分析乳腺组织中γδT细胞的动态变化、应答规律和分泌细胞因子特征;利用TCRδ^-/-小鼠,探究乳腺γδT细胞在感染S.aureus后的主要功能。利用Vγ4抗体清除的小鼠和IL-17A^-/-小鼠,明确乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中发挥作用的机制。研究内容及方法:建立小鼠S.aureus乳腺感染模型,检测感染24 h内乳腺组织及脾脏中NK细胞、NK T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞以及γδT细胞的动态变化;流式细胞术和ELISA法检测乳腺组织内γδT细胞的表型及分泌细胞因子情况。利用TCRδ^-/-小鼠乳腺感染模型,检测敲除γδT细胞后乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化、趋化因子表达量、嗜中性粒细胞数量及MPO活性;流式细胞术分析小鼠乳腺Th1,Th2,Th17,Tc以及Treg细胞变化情况,明确乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中所发挥的功能。进一步,分析S.aureus感染后乳腺γδT细胞的亚型,明确其主要亚型Vγ1和Vγ4γδT细胞的动态变化及分泌细胞因子特征。利用InVivoMAb anti-mouse TCR Vγ1（clone 2.11）单克隆抗体和InVivoMAb anti-mouse TCR Vγ4（clone UC3-10A6）单克隆抗体清除乳腺Vγ1和Vγ4γδT细胞,检测乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化情况及嗜中性粒细胞募集情况,确定乳腺Vγ1和Vγ4γδT细胞在S.aureus感染中的作用。最后,利用IL-17A^-/-小鼠,检测乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化、趋化因子表达及嗜中性粒细胞募集情况,分析探讨乳腺Vγ4γδT细胞在抗S.aureus感染中的作用机制。实验结果:1)S.aureus感染小鼠乳腺后,乳腺组织中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞及NK T细胞无显著变化,而γδT细胞变化显著。在感染24 h内,乳腺内γδT细胞呈先升高后降低的趋势,感染S.aureus 3 h后达到峰值,至24 h时其比例降为1.95%,与对照组相比差异不显著。对乳腺中γδT细胞表型进行检测后发现其高表达CD44和CD69分子,进一步对γδT细胞分泌的细胞因子进行检测后发现,乳腺γδT细胞主要分泌IL-17A和IFN-γ。2)S.aureus感染TCRδ^-/-小鼠后,对乳腺内细菌定殖量和病理变化情况进行检测,结果发现TCRδ^-/-小鼠乳腺组织细菌定殖量显著升高,乳腺组织病理程度加剧。进一步探究发现TCRδ^-/-小鼠乳腺组织中趋化因子KC、MIP-2及IL-8的表达量显著降低,中性粒细胞数量显著减少,组织MPO活性显著下降,IL-17A和IFN-γ的表达量降低。另外,与WT小鼠相比,TCRδ^-/-小鼠乳腺及脾脏中Th1、Th17、Tc以及Treg细胞比例显著降低,而Th2细胞比例则无明显变化。提示乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中起到免疫保护作用。3)S.aureus感染小鼠乳腺后,流式细胞术检测γδT细胞主要亚型及其动态变化情况,结果发现,Vγ1和Vγ4γδT细胞在感染后3 h和6 h的比例显著升高,与对照组相比差异显著;进一步发现,Vγ1γδT细胞在S.aureus感染早期主要产生IFN-γ,而Vγ4γδT细胞在S.aureus感染早期主要产生IL-17A。利用抗体分别将乳腺组织内Vγ1γδT细胞和Vγ4γδT细胞清除,结果发现,与对照组相比,Vγ1γδT细胞清除小鼠和Vγ4γδT细胞清除小鼠乳腺内细菌定殖量均显著增加,病理程度加剧,中性粒细胞数量显著降低,提示Vγ1和Vγ4γδT细胞是乳腺抵御S.aureus感染的主要γδT细胞亚型。4)进一步利用IL-17A^-/-小鼠,探讨Vγ4γδT细胞在S.aureus感染中的机制。结果发现,与WT组小鼠相比,IL-17A^-/-小鼠乳腺中细菌定殖量显著增加,病理程度加剧,趋化因子KC、MIP-2及IL-8的表达量显著降低。流式细胞术检测WT小鼠与IL-17A^-/-小鼠乳腺组织内中性粒细胞的数量,结果显示,与WT组相比,IL-17A^-/-小鼠乳腺内中性粒细胞数量显著降低,提示γδT细胞是通过分泌IL-17A,进而招募趋化因子,募集中性粒细胞,清除细菌,发挥免疫保护作用。研究结论:1.γδT细胞是乳腺感染S.aureus早期最主要的T淋巴细胞类型。这类细胞高表达CD44和CD69分子,并分泌IL-17A和IFN-γ。2.敲除γδT细胞后,乳腺中性粒细胞和趋化因子减少,乳腺炎症和细菌定殖量增加。表明γδT细胞在乳腺S.aureus感染早期对细菌清除和降低组织损伤方面起关键的正调控作用。敲除γδT细胞后,乳腺Th1、Th17、Tc以及Treg细胞比例降低,提示γδT细胞可能对机体适应性免疫应答具有一定的调节作用。3.S.aureus感染后,γδT细胞以Vγ1和Vγ4两种亚型为主,Vγ1γδT细胞主要分泌IFN-γ,Vγ4γδT细胞主要分泌IL-17A。Vγ1γδT细胞和Vγ4γδT细在乳腺S.aureus感染早期对细菌清除和降低组织损伤方面起关键的正调控作用,是抵御S.aureus感染的主要γδT细胞亚型。4.乳腺Vγ4γδT细胞通过分泌IL-17A,进而招募趋化因子,募集中性粒细胞,清除细菌,发挥免疫保护作用。本研究丰富了乳腺局部抗感染免疫应答的资料,为S.aureus乳腺炎的预防和治疗提供理论依据与实验数据。