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猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病,死亡率极高,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟已被世界动物卫生组织(OIE)列为家畜A类传染病,我国也将其列为一类动物疫病。多年的实践经验证明,疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。20世纪60年代,我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗在猪瘟病毒防控中起到了决定性作用,有效的控制了猪瘟在我国大规模的流行。但目前猪瘟仍在我国各大养猪地区呈非典型性和地方性流行,说明兔化弱毒疫苗已不能完全控制猪瘟的发生和流行。因此,研制新型疫苗已成必然趋势。本文构建了表达CSFV Shimen株E0/E2基因的重组腺病毒pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2,并对这3种重组腺病毒疫苗的免疫效果进行了研究,为研制猪瘟病毒活载体疫苗奠定了坚实的基础。1.表达CSFV E0 /E2基因的重组腺病毒pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2的构建及鉴定。首先用PCR方法分别从pMD-18T-E0和pMD-18T-E2质粒中扩增出E0基因和E2基因,分别将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建出重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-E0和pAdTrack-E2。将E0基因和E2基因在载体pET-32a中串联,用Kpn I和Not I双酶切得到E0-E2串联基因片段,将其定向克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中得到重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-E0-E2。用Pme I内切酶分别对pAdTrack-E0、pAdTrack-E2和pAdTrack-E0-E2质粒酶切线性化,回收后转化含有腺病毒骨架载体pAdEasier-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中,穿梭载体和骨架载体发生同源重组,分别得到含有E0基因、E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒骨架载体pAdEasy-E0、pAdEasy-E2和pAdEasy-E0-E2。用Pac I内切酶分别酶切pAdEasy-E0、pAdEasy-E2和pAdEasy-E0-E2,琼脂糖凝胶电泳分别回收后通过脂质体介导法将这3种骨架载体转染HEK293细胞,获得了含有目的基因的重组腺病毒pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2。用同样的方法制备对照空载腺病毒pAd-CMV。该重组病毒能在293细胞上产生典型的细胞病变。PCR和Western blot检测证实,这3种重组腺病毒能稳定携带并表达E0、E2和E0-E2蛋白。体外连续传代试验表明,本试验构建的重组腺病毒具有良好的遗传稳定性。2.以小鼠为动物模型评价以上3种重组腺病毒的免疫效力。将12只Balb/c小鼠随机分为3组(每组4只),分别腹腔途径注射经过扩增和纯化的pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2重组腺病毒,接种剂量为1×108 pfu/只,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后每周采血,用猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒检测抗体,结果表明,通过2次免疫后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2重组腺病毒均能诱导小鼠产生针对CSFV的特异性抗体,CSFV抗体的滴度最高分别达到1∶10 240、1∶20 480和1∶10 240,这为重组腺病毒疫苗本动物免疫保护性试验研究奠定了良好的基础。3.重组腺病毒对猪的保护性试验。用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品化猪2次(间隔20 d),免疫剂量均为1.2×109 pfu。同时设非重组腺病毒接种组和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组的保护率分别为50 %、75 %和75 %,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的保护率为60 %, pAd-CMV免疫组和空白对照全部死亡;在攻毒前,重组腺病毒免疫组抗体水平普遍较低,商品化疫苗免疫组能100 %检测到抗体,而非重组腺病毒和空白对照没有检测到抗体;攻毒后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组中分别有75 %、50 %和50 %猪体温超过40℃,常规苗试验组80 %体温超过40℃,而对照组所有试验猪体温均超过40℃。临床症状的检测证明该重组腺病毒疫苗能提供一定的保护效果。上述结果,表明仅含有E0基因的重组腺病毒pAd-E0的免疫保护效果和常规疫苗还有距离,含有E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。