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[目的]探讨寒、热属性化合物对恶性肿瘤生物学行为的影响及其内在分子机制?[研究内容与方法]一、探讨寒、热属性化合物对恶性肿瘤生物学行为的影响体内实验:1)构建小鼠实验性肺转移模型,研究辣椒素及薄荷醇对B16F10黑色素瘤肺转移的影响;2)构建裸鼠皮下移植瘤模型,研究辣椒素及薄荷醇对A375黑色素瘤体内生长及肺转移的影响;体外实验:1)采用细胞增殖实验,研究辣椒素及薄荷醇对鼠源性B16、B16F10、及人源性A375黑色素瘤细胞增殖的影响;2)采用划痕实验,研究辣椒素及薄荷醇对B16、B16F10及A375黑色素瘤细胞迁移的影响;3)采用Transwell侵袭实验,研究辣椒素及薄荷醇对B16、B16F10及A375黑色素瘤细胞侵袭的影响;二、寒、热属性化合物对恶性肿瘤生物学行为影响的机制研究1)B16F10及A375黑色素瘤细胞能量代谢类型的研究采用细胞增殖实验结合糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸和氧化磷酸化抑制剂寡霉素研究B16F10及A375黑色素瘤细胞的能量代谢类型;2)辣椒素和薄荷醇对黑色素瘤细胞糖酵解基本过程影响的研究分别采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法、Lactic Acid Assay Kit和ATP Assay Kit,检测辣椒素和薄荷醇对黑色素瘤细胞葡萄糖消耗、乳酸生成及ATP合成的影响;3)辣椒素和薄荷醇对调控糖酵解过程三个关键激酶酶活的影响分别采用紫外分光光度法结合HK Assay Kit、PFK Assay Kit和PK Assay Kit,检测辣椒素和薄荷醇对黑色素瘤细胞中己糖激酶(HK)、6-磷酸果糖激酶(PFK)及丙酮酸激酶(PK)酶活的影响;4)黑色素瘤细胞中辣椒素受体TRPV1和薄荷醇受体TRPM8蛋白及mRNA表达的研究采用Western blot、Q-PCR等方法检测TRPV1和TRPM8在黑色素瘤细胞B16、B16F10、A375及正常皮肤细胞HACAT、JB6中的蛋白及mRNA表达情况;5)辣椒素和薄荷醇对激酶酶活的调控是否依赖其各自受体的研究利用TRPV1抑制剂钌红结合PK Assay Kit,研究辣椒素对PK激酶酶活的调控是否依赖其受体;采用TRPM8抑制剂克霉唑结合HK Assay Kit,研究薄荷醇对HK激酶酶活的调控是否依赖其受体。[结果]体内实验结果:1)小鼠B16F10黑色素瘤实验性肺转移模型实验结果表明,辣椒素能够促进B16F10黑色素瘤在体内的肺转移,且呈一定的剂量依赖性;而薄荷醇能够抑制B16F10黑色素瘤在体内的肺转移,也具有一定的剂量依赖性;裸鼠皮下移植瘤模型结果表明,辣椒素能够剂量依赖性的抑制A375黑色素瘤在体内的生长,薄荷醇也能够抑制A375黑色素瘤在体内的生长,且具有一定的剂量依赖性。与正常组相比,辣椒素和薄荷醇对实验组裸鼠的体重无明显影响,这表明长期使用辣椒素和薄荷醇对于裸鼠没有明显系统毒性。体外实验结果:2)体外增殖实验结果表明,在一定浓度范围内,辣椒素和薄荷醇对黑色素瘤细胞的增殖具有浓度依赖性的抑制作用;划痕实验结果表明,辣椒素能够促进B16F10及A375黑色素瘤细胞的体外迁移,而薄荷醇能够抑制两种黑色素瘤细胞的体外迁移,且都具有一定的浓度依赖性;侵袭实验结果表明,辣椒素能够促进B16F10及A375黑色素瘤细胞的体外侵袭,而薄荷醇能够抑制两种黑色素瘤细胞的体外侵袭,且都具有一定的浓度依赖性;不同浓度的辣椒素和薄荷醇对低转移性的B16细胞的迁移和侵袭均无明显影响。机制部分研究结果:3)氧化磷酸化过程被抑制后,B16F10及A375黑色素瘤细胞的增殖未受到明显抑制;而利用糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸结合细胞增殖实验结果发现,抑制糖酵解过程后,B16F10及A375黑色素瘤细胞的增殖受到了明显的抑制,且在一定范围内具有浓度依赖性。4)辣椒素能够促进黑色素瘤细胞的葡萄糖消耗,而薄荷醇则能够抑制黑色素瘤细胞的葡萄糖消耗;辣椒素能够促进黑色素瘤细胞乳酸的生成,而薄荷醇则能够抑制黑色素瘤细胞乳酸的生成;辣椒素能够促进黑色素瘤细胞ATP的生成,而薄荷醇则能够抑制黑色素瘤细胞ATP的生成。5)辣椒素仅对黑色素瘤细胞中PK的酶活产生影响,且表现为对PK酶活的促进作用,对PFK及HK酶活无明显影响;而薄荷醇仅对黑色素瘤细胞中的HK酶活产生影响,且表现为能够对HK酶活的抑制作用,对PFK及PK酶活无明显影响。6)黑色素瘤细胞中TRPV1及TRPM8蛋白的表达较正常皮肤细胞明显偏高;同时Q-PCR实验结果表明黑色素瘤细胞中两种受体的mRNA表达也较正常皮肤细胞明显偏高。同时实验研究发现,抑制TRPV1后黑色素瘤细胞的迁移明显受到了抑制,而抑制TRPM8后则促进了黑色素瘤细胞的迁移。这一结果与辣椒素和薄荷醇对黑色素瘤迁移的影响是一致的。7)抑制TRPM8后,薄荷醇对HK酶活的抑制作用消失,而抑制TRPV1后,辣椒素对PK酶活的促进作用也消失。实验结果表明辣椒素和薄荷醇对酶活的调控是受体依赖性的。[结论和意义]本论文围绕寒、热属性化合物辣椒素和薄荷醇对黑色素瘤生物学行为的影响,同时从肿瘤能量代谢的角度考察辣椒素和薄荷醇影响黑色素瘤转移可能的作用机理。结论为:(1)辣椒素在体外促进黑色素瘤细胞的迁移、侵袭、体内促进黑色素瘤的肺转移;薄荷醇在体外能够抑制黑色素瘤的迁移、侵袭、体内抑制黑色素瘤的肺转移;(2)B16F10和A375黑色素瘤细胞均为偏糖酵解类型的肿瘤细胞,辣椒素能够促进黑色素瘤细胞的糖酵解过程,而薄荷醇能够抑制黑色素瘤细胞的糖酵解过程;(3)在三个调控糖酵解过程关键酶中,辣椒素作用于PK且表现为对PK酶活的促进作用,而薄荷醇作用于HK且表现为对HK酶活的抑制作用;(4)辣椒素对PK酶活的调控作用是TRPV1受体依赖性的,而薄荷醇对HK酶活的调控作用则是TRPM8受体依赖性的。本课题分别选取薄荷醇及辣椒素作为寒、热属性化合物的代表,意在试图阐明寒、热性食物乃至寒、热属性中药对肿瘤进展的影响究竟有何不同,有助于阐明在以寒性食物和热性食物为食材的地区的肿瘤患者在饮食上的“宜”和“忌”,同时有助于推动寒、热属性中药对肿瘤转移影响的深入研究,对于指导临床寒、热属性中药的规范用药具有重要的理论意义和实用价值。