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子宫腺肌病(Adenomyosis, AM)是指具有生长功能的子宫内膜腺体和间质侵入周围子宫肌层而形成的局限性或弥漫性病变,主要临床症状包括周期性和进行性加重的痛经和经量增多。尽管子宫腺肌病的病因和发病机制不清,但是多数学者认为子宫基底层内膜侵入肌层生长和高雌激素刺激密切相关,并涉及内膜细胞生理、生物化学和分子生物学等机制。雌激素膜受体GPR30(G protein-coupled estrogen receptor, GPR30or GPER-1)是一种7次跨膜G蛋白偶联受体,广泛存在和表达于多种雌激素依赖性疾病。越来越多的研究表明GPR30在乳腺癌,子宫内膜异位症和子宫内膜癌中可以参与调节雌激素介导的非基因组效应。针对雌激素核受体nER的拮抗剂他莫昔芬及其代谢物4-羟基他莫昔芬可以通过结合激活细胞膜上的GPR30刺激ER阳性的人乳腺癌细胞和子宫内膜癌细胞异常增殖和侵袭。微阵列芯片分析指出雌激素和4-羟基他莫昔芬也可以通过GPR30介导的快速基因组效应诱导和促进ER阴性的乳腺癌细胞的增生和迁移。已有研究表明,与非子宫腺肌病患者相比,子宫腺肌病患者在位内膜存在异常的细胞增殖、细胞侵袭和细胞凋亡等细胞生物学行为的变化,但具体机制不清。我们的研究发现,在子宫腺肌病患者的在位内膜和异位病灶中的间质和腺体细胞中存在GPR30的广泛表达,GPR30蛋白和mRNA均呈过表达,且明显高于对照组。第二部分中我们成功设计重组针对人GPR30的shRNA有效片段,包装了高滴度的慢病毒载体；并利用原代培养的人子宫内膜间质细胞,成功建立慢病毒载体感染人子宫内膜间质细胞的条件参数；并成功筛选出2条有效干扰人GPR30表达的shRNA序列。进一步的研究发现,慢病毒GPR30shRNA干扰子宫内膜间质细胞后,GPR30蛋白和信号通路蛋白pAkt/Akt表达均下调；并抑制子宫内膜间质细胞的增殖和迁移能力；同时通过凋亡调节蛋白Caspase-3Active/Pro比值、Bcl-2的表达上调和Bcl-x蛋白表达下调促进子宫内膜间质细胞的凋亡。GPR30介导的雌激素非经典途径可能通过影响子宫内膜细胞的增殖、迁移和凋亡参与该疾病的发生和发展过程。目的：研究雌激素膜受体GPR30在子宫腺肌病患者子宫在位内膜和异位病灶的表达水平。方法：20例子宫腺肌病患者在位内膜和异位病灶,和20例非子宫腺肌病患者子宫在位内膜标本,免疫组织化学法检测在位内膜和异位病灶中GPR30的定位和分布,Western blot和qPCR定量检测GPR30蛋白和mRNA水平的表达水平。结果：GPR30广泛分布于子宫内膜间质和上皮细胞,主要定位于细胞膜,部分细胞浆也有表达。与对照组的低表达相比,子宫腺肌病患者在位内膜高表达的GPR30有月经周期差异,增生期高于分泌期；异位病灶GPR30的表达低于在位内膜的表达,无月经周期差异。子宫腺肌病患者在位内膜和异位病灶上GPR30的蛋白和mRNA水平都高于非子宫腺肌病,有统计学差异(P<0.001,P<0.001)。子宫腺肌病患者在位内膜和异位病灶之间GPR30蛋白和mRNA的表达有统计学差异(P<0.001,P<0.001)。结论：1.GPR30广泛分布于子宫腺肌病患者在位内膜和异位病灶的内膜间质和上皮细胞,主要定位于细胞膜,部分细胞浆也有表达。2.子宫腺肌病患者子宫在位内膜和异位病灶GPR30的表达高于非子宫腺肌病患者在位内膜GPR30的表达。目的：设计构建针对人GPR30干扰序列的慢病毒载体,利用体外培养的人子宫内膜间质细胞摸索最优感染条件参数和筛选有效干扰效率的shRNA序列。方法：按照公用网站RNA干扰序列设计原则,设计特异性靶向人GPR30的4个最佳shRNA序列及1个RNA干扰阴性对照Scramble序列,由上海吉凯基因技术有限公司合成。与mU6-MCS-Ubi-EGFP重组后,转染大肠杆菌感受态细胞。阳性克隆经PCR鉴定及测序鉴定后,抽提质粒后慢病毒包装293T细胞,测定并标定病毒滴度。以体外原代培养的人子宫内膜间质细胞为目的细胞,按照预实验设计原则,荧光显微镜下直观判断感染效率,摸索出慢病毒最优感染条件参数。通过PCR和qPCR检测GPR30mRNA表达水平,鉴定4个shRNA序列的干扰效率。结果：抽提质粒后测序提示插入的4个shRNA序列都正确,包装的慢病毒液滴度测定结果分别是：8×108,5×108,8×108,8×108TU/mL.在添加ENi.S和Polybrene (5μg/mL)条件下,MOI值为50时慢病毒感染人子宫内膜间质细胞8h,换液继续培养72h后荧光显微镜下直观判断感染效率>95%。感染72h后,通过PCR和qPCR检测GPR30的mRNA表达水平明显下降,4个shRNA序列的干扰效率分别为91.53%、81.72%、91.10%和40.65%。结论：1.成功设计重组针对人GPR30的shRNA有效片段,并包装了高滴度的慢病毒载体。2.成功建立慢病毒载体感染人子宫内膜间质细胞的感染条件参数。3.成功筛选出有效干扰人GPR30的shRNA序列。目的：慢病毒载体介导的GPR30shRNA感染人子宫内膜间质细胞后,研究GPR30在细胞增殖、迁移和凋亡中的作用。方法：体外分离培养子宫在位内膜间质细胞,慢病毒GPR30shRNA感染干扰细胞,采用MTT/CCK8.划痕试验和Western blot检测GPR30和pAkt/Akt、及凋亡通路调节蛋白的变化,检测感染后细胞的增殖能力、迁移能力和凋亡能力的变化。结果：子宫内膜间质细胞经GPR30shRNA干扰后连续5天吸光度值的增长水平一直明显低于未干扰组和阴性序列对照组,显示的增殖能力明显下降。经GPR30shRNA干扰后子宫内膜间质细胞迁移能力明显下降,经48h后划痕仍末修复,而未干扰组和阴性序列对照组在划痕12h后出现修复,24h可见划痕距离明显缩小,至48h后划痕完全修复。GPR30shRNA干扰细胞后,与未干扰组和阴性序列对照组相比,GPR30蛋白和信号通路蛋白pAkt/Akt表达明显下调,同时出现凋亡调节蛋白Caspase-3Active/Pro比值和Bcl-2下调,和Bcl-x比值上调,而P53和PARP-1(cleaved p85)表达水平未见明显变化。结论：1.慢病毒GPR30shRNA干扰子宫内膜间质细胞后,GPR30蛋白和信号通路蛋白pAkt/Akt表达均明显下调。2.慢病毒GPR30shRNA干扰子宫内膜间质细胞后,子宫内膜间质细胞的增殖能力明显被抑制。3.慢病毒GPR30shRNA干扰子宫内膜间质细胞后,子宫内膜间质细胞的迁移能力明显被抑制。4.慢病毒GPR30shRNA干扰子宫内膜间质细胞后,通过凋亡调节蛋白Caspase-3Active/Pro比值、Bcl-2的表达上调和Bcl-x蛋白表达下调促进子宫内膜间质细胞的凋亡。