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目的:表皮松解性掌跖角化症(epidermolytic palmoplantar keratoderma,EPPK,OMIM:144200)是一种常染色体显性遗传性皮肤病,以掌跖部的角化性斑块为主要临床特点。EPPK具有遗传异质性,已有不同民族及种族中EPPK致病基因的相关报道。目前仍未见有维吾尔族人群关于EPPK致病基因及发病机制的相关报道。本研究收集一维吾尔族表皮松解性掌跖角化症大家系临床症状,绘制其家系图,分析维吾尔族EPPK遗传特征。通过全基因组外显子测序结合前期连锁分析发现EPPK的候选致病基因。通过对候选致病基因进行验证,明确维吾尔族EPPK的致病基因。为了更好的了解致病基因在EPPK中的发病机制,本研究利用免疫组化的方法进一步探查由于致病基因突变,可能导致表皮内的角蛋白表达异常,为EPPK的发病机制研究提供一定的理论基础。EPPK目前无特异性治疗方法,RNA干扰技术已应用与相关单基因疾病的研究,本研究通过siRNA转染入角质形成细胞中,特异性抑制致病基因的表达。本研究初步阐明了EPPK的发病机制,为EPPK的早期诊断、RNA干扰技术的靶向治疗提供一定的理论基础和实验依据。方法:(1)对家系中的两名患者(IV56和III31)进行全基因组外显子测序,结合前期连锁分析结果筛选候选基因。(2)利用软件预测突变对蛋白功能的影响进一步筛选,减少候选基因数量。(3)通过PCR测序方法,家系内及健康对照验证,同时收集一维吾尔族EPPK小家系进一步验证。(4)化学合成致病基因特异的siRNA序列与质粒,利用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染共到HaCaT细胞中。(5)采用RT PCR和Western blot方法检测转染前后HaCaT细胞中KRT9 mRNA和蛋白水平的变化情况。(6)RT PCR检测siRNA转染前后KRT1、KRT5、KRT6、KRT16、KRT10、KRT14及KRT12的mRNA水平的变化。(7)共聚焦显微镜检测siRNA转染前后细胞骨架结构变化。(8)免疫组化法检测EPPK患者与健康对照中其它相关角蛋白的表达量及表达位置是否具有差异性。结果:(1)经过全基因组外显子测序后,结合前期连锁分析结果,家系内外验证,维吾尔族EPPK致病基因为KRT9 c.C487T(p.R163W)。(2)针对HaCaT细胞转染入KRT9 c.C487T(p.R163W)质粒,使其突变的K9过表达,针对突变位点设计siRNA,转染入过表达细胞中,RT-PCR及weston bolt结果显示K9-R163W组及k9-R163W+siRNA-R163W组,KRT9 mRNA的相对表达量分别是1.063±0.159,0.242±0.051,蛋白的相对表达量分别是1.1329±0.131,0.289±0.036。针对突变位点设计的siRNA能显著抑制KRT9 R163W的相对表达量(P<0.05)。(3)KRT9 c.C487T(p.R163W)高表达时,KRT6、KRT16及KRT10 mRNA水平表达较KRT9 c.C487T(p.R163W)低表达时具有统计学差异(P<0.05)。(4)KRT9 c.C487T(p.R163W)高表达时,角质形成细胞的骨架结构呈杂乱无序状态,部分细胞骨架结构消失。(4)免疫组化蛋白表达分析结果显示,EPPK皮损较正常健康对照表皮中出现K5,K2蛋白表达量的下调,K10,K6和K16蛋白表达量的上调;Ki-67和p63蛋白表达量和分布发生改变。结论:(1)KRT9 c.C487T(p.R163W)为导致此维吾尔族表皮松解性掌跖角化症发病的致病突变,其的遗传学发病机制提供了理论基础。(2)应用RNA干扰特异性干扰突变型KRT9 c.C487T(p.R163W)基因及野生型KRT9的表达,证明致病基因高表达时引起病损组织角蛋白的平衡破坏,影响细胞的骨架结构,低表达时则细胞结构不受破坏,为表皮松解性掌跖角化症的发病机制研究及基因治疗提供新的思路。(3)针对KRT9 c.C487T(p.R163W)突变位点siRNA能特异性抑制突变KRT9基因的表达,为EPPK的靶向治疗提供理论依据。(4)KRT9 c.C487T(p.R163W)的基因突变,可能导致病损组织细胞角蛋白的平衡遭到破坏,病损组织基底细胞存在过度增殖的现象,是导致EPPK的发病基础。