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鸭坦布苏病毒病（duck Tembusu virus disease）是于2010年在我国新出现的一种以采食、产蛋下降和瘫痪为特征的禽类传染病,其病原为鸭坦布苏病毒（duck Tembusu vius,DTMUV）。DTMUV主要危害鸭和鹅,也有鸡群感染发病的报道,不同来源的DTMUV分离病毒株的基因同源性均高于98%。该病在蚊虫活跃季节发病率高,但冬季也有发病,因此传播途径不限于蚊媒。鸭坦布苏病毒为黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群中的坦布苏病毒（Tembusu virus）。病毒的基因组为正股单链RNA,长约11 knt,基因组结构为5’UTR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’UTR。囊膜蛋白（E）是DTMUV主要的表面结构蛋白,参与病毒与宿主细胞受体的结合,含有病毒的主要中和抗原表位。DTMUVNS1蛋白参与病毒的组装,也可以二聚体或六聚体的形式分泌至胞外,拮抗宿主的先天性免疫。E蛋白和NS1蛋白为DTMUV的2个最主要免疫保护性抗原,关于其抗原表位信息报道较少。本研究分离鉴定了一株鸭源坦布苏病毒,研究其生物学特性,测定其全基因序列,分析其基因进化特征。应用细胞融合技术制备了 4株抗DTMUV E蛋白和NS1蛋白的单克隆抗体,其中针对E蛋白的单克隆抗体能区分DTMUV和日本脑炎病毒（JEV）抗原,DTMUV囊膜蛋白特异抗原表位的发现为DTMUV血清学诊断方法的建立奠定基础。具体研究如下:1鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析2012年10月徐州地区某鸭场爆发了樱桃谷种鸭产蛋骤然下降的疫病,患病鸭表现为发热、采食减少、产蛋下降,剖检可见脾肿大、卵泡出血、萎缩等。本研究从送检病料中分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株。DTMUV XZ-2012株能适应鸡胚培养,于BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU/mL。应用RT-PCR的方法扩增DTMUV XZ-2012基因,测序发现其基因组全长为10990nt,编码的多聚蛋白有3426个氨基酸。DTMUV XZ-2012株与文献报道的BYD株、YY5株、JS2010株等DTMUV的全基因同源性为98.5%-99.3%。与国内最初分离的DTMUV BYD株等相比,DTMUV XZ-2012的基因变异主要分布于E基因、NS1基因和NS2a基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力。2鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的制备与特性鉴定用纯化的鸭坦布苏病毒重组EDⅢ蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,共获得2株能稳定分泌抗鸭坦布苏病毒EDⅢ抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C4和3D12。经间接ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价均为1:12800。腹水效价分别为1×105和2×105。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,3C4株单抗的亚类为IgG1κ型,3D12株单抗的亚类为IgG2bK型。间接免疫荧光试验与Westernblot鉴定结果表明3C4、3D12株杂交瘤细胞能特异性识别细胞中鸭坦布苏病毒的EDⅢ蛋白,与日本脑炎病毒没有交叉反应。中和试验显示这两株单抗没有中和活性。3鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备利用纯化的鸭坦布苏病毒NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,共获得2株能稳定分泌抗鸭坦布苏病毒NS1蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F6和2F12。经间接ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:6400、1:12800。腹水效价均为1:1×105。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,2F6、2F12株单抗的亚类均为IgG1,2株单抗的轻链均为κ型。Western blot与间接免疫荧光试验鉴定结果表明2F6、2F12株杂交瘤细胞能特异性识别DTMUV接种细胞中的NS1蛋,2F12与日本脑炎病毒接种细胞有交叉反应,2F6与JEVNS1没有交叉反应。4鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白B细胞表位的鉴定为了对获得的2株抗鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白的单克隆抗体所针对的抗原表位进行精确定位,本研究通过原核表达了截短的EDⅢ蛋白,人工合成了多肽抗原。通过ELISA和Western blot方法精确定位了这两株单克隆抗体所识别的抗原表位。结果显示这两株囊膜蛋白单克隆抗体针对的是同一表位310SLVKNP315。经分析发现该表位高度保守,且与其他黄病毒不交叉。以上结果丰富了鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白抗原表位图谱,为EDⅢ蛋白相关功能的进一步研究和鸭坦布苏病毒鉴别诊断奠定了基础。