同种反应性T细胞主要通过直接和间接机制识别同种异型MHC移植抗原，介导同种移植排斥反应。选择性清除或抑制同种反应性T细胞克隆以治疗同种移植排斥是目前移植免疫的研究热点之一，以解决免疫抑制剂治疗所带来的患者整体免疫功能低下的副作用。近年来，借助改造抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，尤其是树突状细胞(DC)，使其细胞膜上表达FasL而制成的Killer-APC在多种移植模型中被成功报道。但细胞治疗所带来的生物安全性问题及不稳定性在很大程度上限制了它的研究和应用。为了克服细胞治疗的缺陷，2008年4月，Schutz等将抗人Fas单抗以及HLA-A2/抗原肽复合体共同包被于细胞大小的磁珠，制成杀伤性人工抗原提呈细胞(Killerartificial APC，KaAPC)，在体外细胞共孵育中能有效地选择性诱导病毒抗原和肿瘤抗原特异性CTL细胞株凋亡，提示了KaAPC在自身免疫性疾病和同种异体移植中的潜在应用价值。但是利用KaAPC对同种反应性T细胞的体内外清除研究仍未见报道。　　 本研究利用同尾酶酶切-连接策略和常规方法构建、表达和纯化了6种“抗原肽-linker-β2m”和“H-2Kb-BSP”重组蛋白；利用稀释复性法和本实验室设计的pull-down式色谱复性法制备了H-2Kb/肽复合体及其四聚体；利用H-2Kb/TRP2180-188复合体和抗鼠Fas单抗制备了胶乳微球式KaAPC，研究其在皮肤移植鼠体内选择性清除同种反应性T细胞的能力。研究结果如下：　　 1、利用同尾酶酶切-连接策略成功构建了3种重组质粒，分别是：pET28a-TRP2180-188-linker-mβ2m、pET28a-OVA257-264-linker-mβ2m、pET28a-HER2/neu369-377-1inker-hβ2m，利用常规酶切-连接方法构建了另3种重组质粒：pET28a-MARTl27-35-linker-hβ2m、PET28a-HLA-A2(α1/α2)/Kb(/α3)-BSP，pET28a-H-2Kb(α1/α2/α3)-BSP。这6种重组质粒含有序列正确的目的基因，相应的重组融合蛋白被成功表达和纯化。　　 2、利用稀释法和pull-down式色谱复性法在体外折叠复性制备H-2Kb/肽复合体。将复性后的H-2Kb/肽复合体通过抗His6单抗的桥联作用间接包被于胶乳微球表面，经H-2Kb分子构象特异性荧光单抗染色和流式分析证实，与荷兰Sanquin公司的商品化H-2Kb/TRP2180-188单体的荧光强度完全一致，说明自制的H-2Kb/肽单体具有正确的空间构象。对皮肤移植受者鼠(H-2Kd型)同种反应性T细胞的四聚体染色显示，H-2Kb/TRP2180-188四聚体能与特异性TCR结合，其染色效率与商业化产品无明显差异。　　 3、利用H-2Kb/TRP2180-188复合体和抗鼠Fas单抗共同包被细胞大小的胶乳微球，制作以H-2Kb分子为靶抗原的Killer-aAPC，以C57BL/6鼠(H-2Kb型黑鼠)和BALB/c鼠(H-2Kd型白鼠)为供受体进行皮肤移植。受者BALB/c鼠行皮肤移植术后每日观察排斥反应和记录临床评分，在第5，7，9天经尾静脉注射Killer-aAPC beads或anti-Fas beads或anti-His6 beads，而后在第7、9、11天的时间点各选部分鼠取脾脏细胞进行凋亡检测、H-2Kb/肽四聚体染色、细胞膜分子CD69和CD25染色、IFN-γ胞内染色以及CFSE染色法的同种增殖反应等实验。初步结果显示，KaAPC治疗组的皮肤移植排斥一般比对照组推迟7天以上，皮肤移植局部T细胞浸润明显少于对照组(HE染色)；KaAPC治疗组小鼠脾细胞群中H-2Kb分子特异性T细胞的频率明显少于对照组(H-2Kb/肽四聚体染色)，而T细胞群中凋亡细胞的比例并未与对照组有显著差异(Annexin V/PI双染)，提示受者鼠T细胞库可能未受明显影响；KaAPC治疗组小鼠脾细胞在体外被aAPC刺激后分泌IFN-γ的水平与对照组无显著性差异(IFN-γ胞内染色)；KaAPC治疗组小鼠脾细胞在体外被供者鼠脾细胞刺激后的同种增殖能力比对照组明显降低(CFSE染色法)。　　 以上结果提示：利用“抗原肽-linker-β2m”融合策略及本实验室设计的“同尾酶技术”和“pull-down式复性方法”(孟凡岩博士设计)成功地制备了具有功能的H-2Kb/肽复合体及荧光四聚体；利用H-2Kb/TRP2180-188复合体制作的Killer-aAPC在皮肤移植鼠体内能选择性诱导同种异体反应性T细胞凋亡，推迟临床排斥反应的发生，提示了其在控制同种移植排斥中的潜在应用价值。