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棉花属于锦葵科棉属中的一个具有种子表皮毛(纤维)的异源四倍体植物种,是一类重要的经济作物。棉纤维是纺织工业的重要原料,它是由胚珠的表皮细胞分化形成的一类单细胞。棉纤维细胞发育需要经历四个不同的时期:起始、伸长、次生细胞壁加厚以及成熟期。细胞壁是纺织工业中鉴定纤维品质的重要参数,因此研究棉花纤维的细胞壁对于纺织工业的发展显得尤为重要。棉纤维的细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素以及糖蛋白组成,并且细胞壁的组分随着棉纤维发育的进程而变化。其中,阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactanproteins,AGPs)是棉纤维细胞壁糖蛋白的一种重要组分,该类蛋白在棉纤维的发育过程中发挥重要作用,影响棉纤维的长绒以及短绒的发育。这类蛋白是高度糖基化蛋白,首先是氨基酸主链上的脯氨酸被脯氨酸羟化酶(prolyl-4-hydroxylases,P4Hs)羟基化,随后糖基转移酶(Glycosyltransferases,GalTs)将羟脯氨酸糖基化。我们在前面的研究中利用脯氨酸羟化酶的抑制剂处理棉花离体胚,发现该酶活性被抑制后,棉纤维伸长发育也被抑制,这表明该酶可能涉及到棉纤维伸长发育的调控过程。为深入研究脯氨酸羟化酶在棉纤维发育中的作用,我们分离鉴定了几个可能参与AGPs脯氨酸羟基化的P4Hs。本文对其中的GhP4H2在棉花纤维发育过程中的功能进行了研究,主要分析了以下几个方面:1、GhP4H2过量表达(OE)和RNA干涉(RNAi)转基因棉花遗传及表型分析为研究GhP4H2在棉纤维发育中的功能,构建了的OE载体和RNAi载体,转化棉花,最终获得GhP4H2转基因棉花及其后代株系。对GhP4H2转基因棉花的不同株系(OE株系OE L38和L10,RNAi株系RNAi L16和L28)进行了相关的遗传及表型等分析。通过qRT-PCR(实时定量RT-PCR)技术,对GhP4H2转基因棉花进行表达分析,鉴定OE株系和RNAi株系中GhP4H2表达量的变化。结果显示GhP4H2的表达量在转基因棉花后代(T1、T2和T3代)的5 dpa(day post anthesis)和10 dpa纤维中都发生了显著的变化,其中OE株系OE L38和L10的表达量相对于WT(wild type,野生型)明显升高,而RNAi株系RNAi L16和L28表达量较WT显著下降,并且表达量变化在不同代数间都能稳定遗传。收取成熟的棉铃进行表型分析,通过比较各个株系的棉纤维长度以及短绒的表型,发现OE株系的成熟棉纤维明显变短,而RNAi株系成熟棉纤维与WT相比未见明显变化,通过对GhP4H2转基因棉花T3代成熟纤维进行品质分析,获得相同的结果。另外,RNAi株系的短绒相对于WT明显变少,甚至消失。以上两个表型变化暗示GhP4H2对棉花纤维发育具有重要影响。2、GhP4H2转基因棉花10 dpa纤维细胞壁分析为研究GhP4H2表达改变是否影响棉纤维细胞壁结构,对1Odpa棉纤维进行树脂切片以及石蜡切片,观察其细胞壁以及细胞形态的变化,发现OE株系的细胞相对于WT明显增大,而RNAi株系的细胞大小与WT相比没有明显差异,但细胞排列变得更加紧密,且更加规则。3、GhP4H2转基因棉花10 dpa纤维中AGP含量以及糖链变化的分析为检测GhP4H2表达改变是否会影响AGP的合成,提取GhP4H2转基因棉花10 dpa纤维AGP,发现OE株系的AGP含量相对于WT升高,而RNAi株系的AGP含量较WT明显降低,利用JIM8,JIM13和MAC207三种分别能与AGP糖侧链上不同糖基抗原决定簇特异结合的抗体进行Dot blot分析,结果显示,OE株系的AGP含量明显大于WT,而RNAi株系结果却相反。推测GhP4H2能够影响细胞壁糖蛋白AGP的合成。4、GhP4H2转基因棉花纤维转录组分析为研究GhP4H2可能的作用底物,选择了 RNAi L28-35、OE L38-17以及WT进行转录组测序。结果显示差异最显著的基因是参与细胞壁组分合成和修饰的基因,在OE L38-17中,共有202个基因上调,除去无参考序列的新基因(novel gene),还剩160个基因,其中有27个细胞壁合成与修饰相关基因,占到17%,这27个中又有10个为富含羟脯氨酸的蛋白(Hyp-rich proteins)。此外,根据pval值越小,差异倍数越大,上调差异倍数最大的前50个基因,去除novel基因,剩下30个有注释的基因。30个基因中有7个是细胞壁相关基因,占到23%,这7个基因中又有4个为Hyp-rich proteins。由此推测富含羟脯氨酸的蛋白可能是GhP4H2的作用底物。为验证转录组结果的可靠性,我们设计了这些编码羟脯氨酸蛋白基因的RT-PCR引物,利用qRT-PCR技术检测了这些基因在OE株系和WT中的表达水平,发现这些编码羟脯氨酸蛋白的基因在OE株系中表达显著上调,进一步验证了转录组数据的可靠性,也说明GhP4H2能够正调控影响糖蛋白合成的相关基因的表达。考虑到GhP4Hs位于GalTs的上游,我们也检测了 7个可能参与AGP糖链合成的GhGalTs的表达,发现其中的4个GhGalTs基因表达上调。同时根据差异基因参与的代谢过程富集图以及差异基因调控代谢通路的KEGG pathway散点图推测出GhP4H2参与调控的代谢通路。这些结果表明GhP4H2参与棉花纤维生长发育过程。5、酵母双杂交分析GhP4H蛋白之间的相互作用为研究GhP4H2是否是以二聚体的形式参与调控羟脯氨酸的合成,我们根据GhP4Hs系统进化树选择与GhP4H2亲缘关系最近的两个GhP4Hs进行检测。构建了 pGAD-GhP4Hs 和 pGBKT7-GhP4Hs 载体,分别转化酵母菌 AH109 和 Y187(pGAD-GhP4Hs 转化 AH109,pGBKT7-GhP4Hs 转化 Y187)。检测转化成功后,pGBKT7-GhP4Hs与pGAD-GhP4Hs两两融合,之后将融合后的蛋白在缺陷型培养基上进行筛选,检测到GhP4Hs间不能发生相互作用,该实验还在重复检测。