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研究背景与目的肺癌是全世界发病率死亡率最高的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌总数85%,严重影响人类的生存质量。目前大多数NSCLC诊断时已进展至中晚期,失去最佳治疗时机,故NSCLC的早期诊断意义重大。外泌体(exosomes)是一类由脂质双分子层包裹的纳米小囊泡,携带着大量亲本细胞分泌的生物信息分子,如蛋白、核酸、脂类等。Exosomes可通过体液将其内包裹的核酸、蛋白质等生物大分子远距离转运至靶细胞,通过内吞或配体结合等方式使生物信息分子进入靶细胞,发挥相应功能,调控机体多种生理过程。外泌体中蛋白质是参与疾病发生发展的重要部分。外泌体还携带了特异的疾病信息,介导疾病的发生发展,具有生物标志物的潜力。故本文旨在通过建立一套血清及细胞来源exosomes分离纯化鉴定方法,然后进行NSCLC早晚期患者、健康人志愿者、NSCLC细胞系A549与正常人支气管上皮细胞系16HBE来源exosomes差异蛋白组学初步分析,尝试筛选NSCLC早期诊断候选标志物。方法首先利用差速超速离心法分离细胞和血清来源exosomes,并对血清exosomes加以蔗糖垫纯化。随后用TEM、Nanosight、western blot鉴定分离出的exosomes,分析其分离效果并用Nanosight 比较NSCLC与健康人血清exosomes浓度及粒径分布。收集NSCLC早期患者8例、晚期患者8例、健康志愿者12例分为三组混合血清,NSCLC细胞系A549、正常人支气管上皮细胞系16HBE细胞上清,分离纯化血清及细胞上清exosomes,提取exosomes蛋白并酶解成肽段,进行高效液相色谱分离后运用Q-Exactive质谱仪进行label free LC-MS/MS,运用LFQ非标定量分析查库定量NSCLC与健康人差异蛋白,最后通过生物信息学对差异蛋白进行初步分析预测。结果1.血清及细胞上清exosomes分离与鉴定Nanosight鉴定提取产物颗粒直径主要分布于30-150nm之间,TEM可观察到大小均匀、形态一致100nm左右的杯状或圆形脂质双层膜的囊性结构,均符合exosomes形态描述。Western Blot方法能检测到提取的颗粒蛋白溶液有exosomes特异的标志分子(CD63、TSG101)表达,exosomes阴性标志分子calnexin不表达。2.血清及细胞上清exosomes质谱分析所有样品LC-MS/MS技术重复三次。质谱定性到的蛋白质共计3172个,按照筛选标准Ratio>2或<0.5,P value<0.05作为显著性差异阈值,筛选每组差异蛋白质(包括蛋白差异表达、蛋白唯一表达)数量为:早期NSCLC患者与健康人血清exosomes比较共有142种差异蛋白,与健康人相比,早期NSCLC患者血清exosomes显著性上调蛋白25种,下调蛋白33种。与健康人相比,晚期NSCLC患者血清exosomes显著性上调蛋白23种,下调蛋白27种,共有162种差异蛋白。NSCLC早期与晚期患者血清exosomes 比较,差异蛋白有160种,与早期NSCLC患者相比,晚期NSCLC患者血清exosomes显著性上调蛋白25种,下调26种。早期NSCLC、晚期NSCLC患者与健康人血清exosomes三组比较,总共有297种蛋白有显著性差异(P<0.05)。NSCLC细胞系A549与正常支气管上皮永生化细胞系16HBE exosomes 比较,与16HBE细胞系相比,A549细胞exosomes显著性上调蛋白有65种,下调蛋白有62种。3.血清及细胞来源exosomes差异蛋白组学分析以蛋白表达差异倍数从高到低排序,可发现筛选到FGA、FGB、FN1、angiopoietin 1等蛋白在各组间均有显著性差异。与健康人相比,早期、晚期NSCLC患者血清exosomes这些蛋白差异倍数都很高,甚至高达几十倍。通过生物信息学对差异蛋白预测,其中MHC2、MHC1、VCAN、CNTN1、ICAM1等差异蛋白富集在细胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)通路,与肿瘤转移密切相关。细胞上清exosomes间差异蛋白富集主要涉及肿瘤代谢相关的生物学进程及肿瘤细胞转移机制相关的通路。结论1.采用差速超速离心法可成功提取血清和细胞上清exosomes,并适用于后期蛋白组学质谱分析。2.Nanosight 比较NSCLC患者与健康人血清exosomes颗粒浓度、粒径大小及分布均有显著性差异(p<0.001),NSCLC血清exosomes颗粒浓度低于健康人,exosomes粒径大于健康人,分布也更不均一。3.利用高通量质谱技术分析比较早、晚期NSCLC患者与健康人血清exosomes差异蛋白组及NSCLC细胞系A549、正常支气管上皮细胞16HBE细胞exosomes差异蛋白组,结果表明差异蛋白大多富集于各类物质的代谢过程、内皮细胞受体途径、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的粘附等与肿瘤发生发展有密切关联的生物学进程中。4.筛选候选exosomes蛋白标志物通过生物信息学预测及差异倍数比较,可筛选FGA、FGB、FN1、SLC2A1、MHC2、VCAN、CNTN1、ICAM1等可能作用于NSCLC进展的差异蛋白继续下一步的验证。