重亚硫酸盐转化法是目前广泛应用于检测DNA中5-甲基胞嘧啶的方法。经过重亚硫酸盐的修饰,DNA中未甲基化的胞嘧啶会脱氨基转化成尿嘧啶,而5-甲基胞嘧啶则不变。但是传统的重亚硫酸盐转化方法耗时长,DNA降解率高,不利于应用。因此,我们的目的是改善传统的转化方法,保证对胞嘧啶的转化效率,降低DNA降解率,缩短反应时间。然后,将改善的转化方法应用于胃癌中RPRM基因甲基化的研究。通过甲基化敏感熔解曲线分析的方法,评估不同种类的重亚硫酸盐、高温变性温度、转化反应温度、抗氧化剂和变性剂等因素对DNA转化率和降解率的影响。优化的方法使用重亚硫酸盐测序法在多种基因上进行验证。然后以优化的方法,分析胃癌细胞系、胃癌组织、癌旁组织、胃癌血浆和外周血单核细胞(PBMC)样品基因组DNA中RPRM基因启动子的甲基化情况,明确RPRM基因甲基与胃癌的关联性。通过对各个因素的研究,我们发现高温变性是导致DNA降解的主要因素,乙二醇二甲醚(DME)可显著促进转化过程,优化的方法为,使用4MNaHSO3和10%DME,结合转化条件95℃ 3min,(95℃ 30 s,7℃ 10min)×12cycles,即可在短至2 h左右完成DNA的转化过程,且DNA转化率与商业化试剂盒无异,可方便应用于DNA甲基化研究。随后我们用改进的重亚硫酸盐转化法及甲基化敏感熔解曲线分析法在胃癌细胞系和胃癌临床样品中进行RPRM基因启动子甲基化的分析。结果发现胃癌细胞系和胃癌组织中高程度的RPRM基因启动子甲基化,表明其与胃癌有较强的相关性;而在相应的血浆样品检测到了一定程度的甲基化,这也意味着通过检测人血浆中RPRM基因启动子的甲基化情况,有助于胃癌诊断。